《生物技术实践》识记内容Word下载.docx
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值得注意的是，实验中所需的棉花不能用脱脂棉，因脱脂棉易吸水，吸水后容易引起污染。
灭菌后，通常将实验用具放入60～80℃的烘箱中烘干，以除去灭菌时的水分。
如果培养基中有葡萄糖，为防止葡萄糖分解碳化，要用500g/cm2压力（90℃以上）灭菌30min。
有些不能加热灭菌的化合物，如尿素（加热会分解），只能用G6玻璃砂漏斗过滤，但玻璃砂漏斗使用前也要在121℃下用纸包好灭菌。
玻璃砂漏斗用后需用1mol/L的HCl浸泡，并抽滤去酸，再用蒸馏水洗至洗出液呈中性，干燥后保存。
进行恒温培养时，要将培养皿倒置，是因为培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，不倒放培养皿会使水蒸气凝结成水滴后，落入培养基的表面并且扩散，菌落中的细菌也会随水扩散，菌落间相互影响，很难在分成单菌落，达不到分离的目的。
细菌扩大培养要用LB液体培养基（通用培养基、常用于做生理学研究和发酵工业），划线分离要用LB固体培养基（常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存）。
“细菌喜荤，霉菌喜素”，通常细菌培养基要用蛋白胨和酵母提取物来配制，还要加入一定的氯化钠，以维持一定的渗透压；
霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。
尽管培养基的配方各不相同，但其基本成分都一样。
在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37℃培养24h后，置于4℃冰箱中保存。
问题：
1．微生物、细菌与大肠杆菌之间有怎样的关系？
2．培养大肠杆菌的LB培养基中有各种物质，为什么选择这些物质，这些物质有什么作用呢？
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出了供其生长繁殖的营养基质——培养基。
虽然各种培养基的具体配方不同，但一般都含有五大营养要素，即水、无机盐、碳源（提供碳元素）、氮源（提供氮元素）和生长因子（不同的细菌需要的各不相同，有物种差异，它主要补充自身不能合成的或合成能力较弱的，但却是生长繁殖必需的物质）。
无机盐作用：
维持渗透压、pH等
3．该实验中这些操作的原因
⑴将大肠杆菌用接种环自斜面转移到液体培养基中培养时，为什么接种环必须先深入到斜面冷却后，才能再取斜面上的菌体？
接种环在取菌体前曾在酒精灯火焰上灼烧灭菌，一直灼烧至红，温度很高，若不冷却就直接用其取斜面上的菌体，菌体可能因为接触高温接种环而死亡，导致大肠杆菌的转移培养失败。
⑵用划线法分离大肠杆菌中，第一次和随后的几次划线前都要灼烧接种环，它们的原因一样吗？
在划线结束后仍然要灼烧接种环这又是为什么呢？
虽然每次灼烧都是为了灭菌，但所灭的菌种和原因却不一样。
灼烧接种环的时间
消灭的菌体
原因
第一次划线前
其他杂菌
防止其他杂菌的侵入而造成污染
随后的几次划线前
上次划线结束后残留在接种环上的实验菌（本实验为：
大肠杆菌）
为了使下一次划线时，接种环上的菌来自上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，最终获得单个菌落，实现菌的分离
最后一次划线结束后
残留在接种环上的实验菌
为了防止实验菌残留于接种环而污染环境和感染实验人员
⑶用划线法分离大肠杆菌时，每次的划线是怎么样的？
对随后的划线的起点有什么要求？
为什么这样要求呢？
划线的要求：
不能出现线条的重叠，第二次以及随后的划线操作，总是从上一次划线的末端开始，不要将最后一区的划线与第一区相连
这样要求的原因：
使线条末端细菌的数目比线条起始处要少，因为划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到有单个细菌繁殖而来的单菌落。
若相连，则可能最后一次划线末端处的细菌与第一次的叠加，细菌的数目不是最少的，不能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终将很难获得单菌落
4．消毒与灭菌一样吗？
消毒：
使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）
煮沸消毒法：
在100℃煮沸5～6min一般物品
巴氏消毒法：
70～75℃煮30min或在80℃煮15min对于一些不耐高温的液体，如牛奶
化学药剂消毒法如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等
灭菌：
使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物（包括芽孢和孢子）
灼烧灭菌：
酒精灯火焰接种工具的灭菌
干热灭菌：
160～170℃下灭菌1～2h玻璃器皿、金属工具的灭菌
高压蒸汽灭菌：
121℃（1kg/cm2压力）下，灭菌15～30min培养基及容器的灭菌
课后作业
1.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?
①胆大心细，操作快捷。
②注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染几率，手和实验服要清洁，减少操作时间，对污染源的改善考虑周到。
③注意微生物生长条件，如pH、渗透压、温度等。
细菌喜中性偏碱性环境，喜蛋白质丰富的物质营养，喜37℃的温度；
而霉菌喜中性偏酸性环境，喜糖类丰富的物质营养，喜25～30℃的温度。
因此，知己知彼也可以减少污染。
2.培养后如何判断是否有杂菌污染？
①从菌落的形态看，是否湿润、透明、黏稠，呈何种颜色等等，是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌的关键指标。
②用显微镜镜检观察其形态、大小，看是否有菌丝、孢子、芽孢等，这也是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌的关键指标。
③上述方法较难区分同类的不同物种，需要借助化学方法和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法，观察有无鞭毛、孢子形态、孢子着生方式、菌丝生长方式、芽孢、毒素及特异生理生化性质等。
3.进行恒温培养时，为什么要将培养皿倒置?
恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上；
如果正放培养皿，则水分形成的水滴会落人培养基表面并且扩散开。
如果培养皿中已形成菌落，则菌落中的菌会随水扩散，菌落间相互影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。
因此恒温培养时，培养皿必须倒置。
4.实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理?
实验完成后，所有接触过细菌的器皿都必须先高压灭菌后再洗涤，特别是培养基，有可能被有害菌体污染，在培养繁殖后，大量有害菌体影响人畜健康，也污染环境，因此必须高压灭菌。
使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃。
对于取样器的取样头，通常是灭菌后在超声波清洗器中加洗衣粉洗涤30min，再用清水洗净，仍可再用。
封口膜也可再使用。
5.如果分离的是转基因的工程菌，如何保证没有被普通的大肠杆菌污染?
转基因用的质粒，不是细菌中原有的质粒，而是通过改造的，通常加入了抗性基因的DNA序列，如抗氨苄青霉素基因。
转基因载体（质粒）转化进人大肠杆菌后，能在含有氨苄青霉素的培养基中生长，而未被转化的就不能生长，其他没有抗氨苄青霉素基因的杂菌也不能生长，这种设计保证了转基因工程菌的纯洁性。
在获得转基因工程菌后，如果为了选择高表达菌株等进行分离，也可使用含抗生素的培养基，这就保证了转基因工程菌不被普通（无抗性基因）的大肠杆菌所污染。
实验2 分离以尿素为氮源的微生物
脲也称尿素，是蛋白质降解的产物。
人和其他哺乳动物的尿中都含有尿素，大量尿素的存在会对环境造成污染。
尿素也是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收。
只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。
有一些细菌含有脲酶，它们可以通达降解尿素作为其生长的氮源。
这类细菌可以从土壤中分离出来。
脲酶
（NH2）2C＝O＋H2O→→→→2NH3＋CO2
本实验的内容是从土壤中分离出能利用尿素的细菌，观察菌落数，并了解它在生态平衡中的作用。
以LB全营养培养基为对照，观察全营养生长的细菌的菌落数。
材料：
1．在100mL烧杯中装入50mL70%酒精，将玻璃刮刀浸泡在其中。
2．在100mL三角瓶中配制好25mL全营养LB固体培养基（0.25g蛋白胨，0.12g酵母提取物，0.25gNaCl和0.5g琼脂糖，水25mL），加上封口膜后灭菌待用。
3．在100mL三角瓶中配制好25mL尿素固体培养基（0.025g葡萄糖，0.12gNaCl，0.12gK2HPO4，0.25g酚红和0.5g琼脂糖，水15mL），加上封口膜后灭菌，待冷却至60℃时，加入通过G6玻璃砂漏斗过滤的10mL尿素溶液（内含2g脲），摇动，法例均匀后待用。
4．将装有4.5mL蒸馏水的5支有塞试管灭菌后待用。
5．在250mL三角瓶中装入99mL蒸馏水，用封口膜盖上，灭菌后待用。
6．土样1g（从有哺乳动物排泄物的地方取得）
步骤：
1．在60℃左右时，将两只三角瓶中已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养基，在酒精灯旁分别倒入两个培养皿中，在水平的超净台上摇匀，平放至凝固。
2．制备细菌悬液。
在无菌条件下，将1g土样加到有99mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即成10－2土壤稀释液。
依此法制备10-3、10-4和10-5土壤稀释液。
取样时，尽量只取悬液。
摇匀，放在试管架上。
3．用涂布分离法分离细菌。
取10-4和10-5的土壤稀释液各0.1mL，分别加到有LB培养基和尿素培养基的培养皿中，再将保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上火焰熄灭，在酒精灯火焰旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上
4．将培养皿倒置，在37℃恒温箱中培养24～48h。
观察菌落数
5．观察。
全营养培养基中有较多的菌落，而尿素为氮源的培养基平板中只有少量菌落。
问题探究
1.用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基，因为琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选。
配制尿素固体培养基时，葡萄糖应用500g/cm2压力灭菌30min（为防止葡萄糖碳化），尿素需经细菌G6玻璃砂漏斗过滤灭菌后加入。
2.实验操作中的注意事项
⑴设立重复组：
统计某一稀释度下平板上的菌落数时，至少要涂布3个平板作重复组，增强实验结果的说服力与准确性。
⑵对照实验
①判断培养基中是否有杂菌污染，需将未接种的培养基同量进行培养。
LB培养基和选择培养基应各有一个空白对照，即不涂布菌液，目的是验证培养基中是否含有杂菌
②判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立LB全营养培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行比较得出结论。
⑶实验结果分析
①培养基中酸碱指示剂产生颜色变化，标志着存在脲酶水解尿素的作用，从而证明这一菌株以尿素为氮源。
红色区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少
②与全营养培养基上的菌落数比较，尿素培养基上只有少数菌落，这一现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占少部分。
3.鉴定方法：
含酚红指示剂、以尿素为唯一氮源的培养基→细菌→指示剂变红，则该细菌能分解尿素
实验4 果汁中的果胶和果胶酶
果胶是植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一，它是由半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯组成的一种高分子化合物，果胶起着将植物细胞粘合在一起的作用，去掉果胶，就会使植物组织变得松散。
果胶不溶于乙醇（也不溶于水），这是鉴别果胶的一种简易方法。
在果汁加工中，果胶不仅会影响出汁率，还会使果汁浑浊。
果胶酶能够分解果胶，分解植物的细胞壁及胞间层，使榨取果汁变得更容易，而果胶分解成可溶性的半乳糖醛酸，也使得浑浊的果汁变得澄清。
果胶酶并不是特指某一种酶，而是分解果胶的一类酶的总称，包括果胶酶和果胶甲酯酶等。
有些微生物，如黑曲霉、苹果青霉等都可用于生产果胶酶。
在食品工业，果胶酶主要应用于水果加工业，主要有：
①水果中的果胶经果胶酶水解后，可降低果汁的粘度，有助于压榨并提高出汁率；
②在进行果汁沉降和离心时，能破坏果汁中悬浮物的稳定性，使其凝聚沉淀，果汁得到澄清；
③经果胶酶处理的果汁比较稳定，不再发生混浊；
④在葡萄酒酿造中加入果胶酶能起到澄清作用，还可促使葡萄汁中的酒石酸发生沉淀；
本实验的内容是探究利用苹果或山楂匀浆制作果汁的最佳条件、检测果胶酶的活性、了解果胶酶对果汁形成的作用和收集果胶酶的应用材料。
1．用小刀除去苹果或山楂果实中带种子的部分，并切成块，加入少量水制成匀浆。
2．取两个100mL的烧杯，编号A、B，各加入5g匀浆，再向A号烧杯中加入10mL黑曲霉的提取液或果胶酶溶液，B号烧杯中加入10mL水，间歇搅拌20～30min。
烧杯号
管号
处理
加酒精前现象
加酒精后现象
A
1
加热
2
不加热
B
3
4
3．取4支试管，编号1～4。
将A烧杯中的混合物放入1号和2号试管中，每管放入4mL；
将B烧杯中的混合物放入3号和4号试管中，每管也放入4mL。
将1号和3号试管放在沸水浴中或酒精灯上加热，观察有何变化？
2号和4号试管不加热。
4．再向上述4支试管中各加入95%的乙醇4mL，观察有什么变化？
将观察结果记入右表中。
1.制作果汁的最佳条件是什么?
品质最好的果汁应该是：
①尽量保留水果中的营养成分。
②具有水果的原始口味。
⑧有更多的固形物。
④分散程度好，不沉淀，不上浮。
⑤有原始的水果色彩。
⑥除去所有的机械组织，更易消化。
因此，能使最多的水果成分溶解或分散在果汁中的条件就是最佳条件，达到这些条件的方法要温和，且对人体无害。
2.果胶酶在制作果汁中起什么作用?
果胶是细胞间的黏连成分，也是果汁中的成分，加入果胶酶可将细胞离析，增加固形物的分散度。
此外，还降低了水果匀浆悬液的黏度，有利于过滤掉不溶物，并使果胶分解成半乳糖醛酸。
3.果胶酶还可能有什么作用?
果胶酶除用于制备果汁外，还用于果酒澄清，同时也作为洗衣粉的添加剂。
加果胶酶的洗衣粉可除去衣服上的果汁、果酱等污垢。
4．实验验步骤中用玻璃捧间歇搅拌20min～30min的目的是什么?
使酶和反应物（果胶）充分接触，有利于化学反应的进行。
5．实验中加热和不加热有什么区别?
为什么?
沸水浴中或酒精灯上加热会使酶失活，试管中加不加酶结果都一样；
不加热时酶保持活性，加酶的试管中果胶水解，而加水的试管中果胶不能水解。
6．实验中加入95％的乙醇4mL后，出现什么现象，为什么?
果胶不溶于乙醇，可以用乙醇来鉴别果胶。
加入95％的乙醇4mL后，含有果胶的试管会出现沉淀，而果胶被水解后不出现沉淀。
7．当探究温度对黑胶酶活性的影响时，哪个因素是变量，哪些图素应该保持不变?
温度是变量，应控制果泥量、果胶酶的浓度和用量、水浴时间和混合物的pH等所有其他条件不变。
只有这样才能保证只有温度一个变量对果胶酶的活性产生影响。
实验6 α－淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测
酶是生物体内各种化学反应的催化剂，它有高度的专一性和高效性。
但酶在水溶液中很不稳定，且不利于工业化使用。
固定化酶就是水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。
固定化的方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法。
将固定化酶装柱，当底物经过该柱时，在酶的作用下转变为产物。
实验内容是用吸附法将α－淀粉酶固定在石英砂上。
一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精。
用淀粉指示剂溶液（KI-I2溶液）测试，流出物呈红色，表明水解产物糊精生成。
α－淀粉酶 β－淀粉酶 糖化淀粉酶
淀粉→→→→糊精→→→→麦芽糖→→→→葡萄糖
遇碘显蓝色 遇碘显红色 遇碘不显色
这里使用的是枯草杆菌的α－淀粉酶，其作用的最适ｐH为5.5～7.5，最适温度为50～75℃
α－淀粉酶的固定化。
在烧杯中将5mgα－淀粉酶溶于4mL蒸馏水中。
由于酶不纯，可能有些不溶物。
再加入5g石英砂，不时搅拌，30min后装入1支下端接有气门心并用夹子封住的注射器中（石英砂体积约为4mL）。
用10倍体积的蒸馏水洗涤此注射器以除去未吸附的游离淀粉酶，流速为1mL/min
1．将灌注了固定化酶的注射器放在注射器架上，用滴管滴加淀粉溶液，使淀粉溶液以0.3mL/min的流速过柱。
在流出5mL淀粉溶液后接收0.5mL流出液，加入1～2滴KI-I2溶液，观察颜色。
用水稀释1倍后再观察颜色
2．实验后，用10倍柱体积的蒸馏水洗涤此柱，放置在4℃冰箱中，几天后再重复上述实验，看是否有相同的结果。
1．与普通的酶相比较，固定化酶有什么优点？
酶固定化后有一定的机械强度，催化反应的过程要连续化、自动化；
酶不溶解在催化反应的溶液中，产物更易纯化；
固定化酶可反复使用，更经济，更利于工厂化生产；
固定化酶提高了酶的稳定性，可较长时间贮存和使用。
2．如何证明洗涤固定化酶柱的流出液中没有淀粉酶？
可在试管中加入1mL可溶性淀粉，再加入几滴淀粉酶柱的流出液，混合后用手握住试管增加温度，几分钟后加1～2滴KI-I2溶液指示剂，如仍呈蓝色，即流出液中没有淀粉酶了。
实验8 果酒及果醋的制作
与酒和醋的生产有关的微生物分别是酵母菌（真菌）和醋杆菌（细菌），它们各有不同的菌种。
菌种的不同，所产生的酒和醋的风味也不同。
本实验的内容是制作果酒和果醋，所用的原料是葡萄或其他果汁。
葡萄酒是酵母利用葡萄糖进行酒精发酵（乙醇发酵）的产物。
酵母菌只有在无氧条件下才能进行酒精发酵，即将葡萄糖氧化成乙醇，而且当培养液中乙醇的浓度超过16％时，酵母菌就会死亡。
葡萄糖氧化成乙醇的反应式如下：
C6H12O6→→2CO2+2C2H5OH
醋杆菌在有氧条件下才能将乙醇氧化为醋酸，醋杆菌所产生醋酸可使培养液中醋酸的含量高达13％。
其反应式如下：
C2H5OH+O2→→CH3COOH+H2O
将适量干酵母放在一小烧杯中，加入少量温水，使干酵母成为糊状。
为使酵母迅速发生作用，可加极少量蔗糖，混匀，放置片刻。
待酵母悬液中出现气泡即可。
用葡萄制作葡萄酒时，一般不加蔗糖，都只用野生酵母，但是本实验为了加速反应，使观察更直观，需要有更多底物参加反应，所以加入酵母使酒精发酵占有优势。
使用高锰酸钾溶液浸泡葡萄的目的是为了防止杂菌污染，也是消灭了野生酵母。
发酵瓶中的液体不能装满（装量不超过2/3）是因为发酵过程中气体产生，如果装满会使液体外溢，导致发酵液损失和瓶口等处污染杂菌，影响产物品质。
用装着水的弯曲玻璃管可以防止氧气进入，发酵产生的二氧化碳可以出去，还可以防止空气中杂菌的污染。
制醋有固态发酵和液态发酵，本实验属于固定化菌体连续发酵工艺。
制醋时要向发酵瓶中通入空气，保证发酵是一个氧化过程，要用棉花过滤是防止空气中的微生物进入。
1．葡萄或其他果实上常有天然的野生酵母存在，为什么上述两个实验都要接种酵母？
生产葡萄酒时一般不加蔗糖，都只用野生酵母。
本实验为了加速反应，使观察更直观，需要有更多底物（蔗糖）参加反应，所以加入酵母使酒精发酵占有优势是必须的。
否则会有许多霉菌生长，出现异味，影响质量。
2．为什么发酵瓶中的液体不能装满？
从以葡萄糖为底物发生乙醇发酵的反应式看，1个葡萄糖分子经乙醇发酵后要产生2个CO2分子，因此，发酵过程中有气体产生。
如果发酵液装满容器，则液体将外溢，一则发酵液会损失，二则瓶口等处会被许多杂菌污染，特别是被霉菌污染，将影响产物品质，所以发酵液不能装满。
3．图中装着水的弯曲玻璃管起什么作用？
装着水的玻璃管可防止氧气进入。
由于厌氧发酵过程中有CO2产生，使瓶内压力加大，CO2气体可以从装有水的玻璃管中出去，减小瓶中的压力。
此外，有水封闭也起着防止被空气中杂菌污染的作用。
4．制酒时必须保证所有用具都是清洁的，为什么？
不论是葡萄或是其他水果，对微生物来将都是良好的培养基，特别是霉菌。
空气中有许多霉菌孢子，也有细菌，如果用具不清洁，就等于向果汁中接种了许多杂菌，它们都可以利用糖繁殖菌体。
这样，我们饮用的就不会是果酒，而是杂菌的培养液了，轻则会影响我们饮用的口感，重则会影响我们的健康。
5．为什么要向发酵瓶中通入空气？
从乙醇进行醋酸发酵的反应式看到，反应是一个氧化过程，需要空气中的氧气，因此要向发酵瓶中通入空气。
6．为什么空气要用棉花过滤？
甲瓶中的酒水混合物和乙瓶中的锯末都含有微生物可利用的养分，进入的空气含有大量微生物，经棉花过滤可防止微生物进入。
7．你所得到的丙瓶中的液体是否就是市售的白醋？
为什么？
怎样才能得到白醋？
市售白醋中除醋酸外，还含有丰富的不挥发性酸、糖、酯、醇等物质，这些物质多为加入的酵母所产生。
只有醋酸不能达到口感好、有香气的目的。
在生产中将一部分丙瓶产物加工成成品，另一部分再与甲瓶溶液一起进入乙瓶，这样可增加口感。
最后的成品需要调兑、过滤、化验，再包装成成品，如光华白醋的流出液含酸可达9.0～9.5％，而成品中只有5％，要经上述过程才能得到市售类型的白醋。
8.为什么在酒精发酵过程中往往“先通气后密封”？
“通气”的目的是使酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖。
“密封”的目的是使酵母菌进行无氧呼吸产生酒精。
9.酒精发酵过程中发生“先来水后来酒”现象，其原因是什么？
酵母菌首先进行有氧呼吸产生了水，然后进行无氧呼吸才产生酒精。
10.葡萄酒呈现深红色的原因？
在发酵过程中葡萄皮的色素进入到发酵液中。
11.酵母菌是如何进行生殖的？
酵母菌在环境适宜时进行出芽生殖，环境不适宜时产生孢子进入休眠状态。
12．果醋制作原理
利用的微生物是醋酸菌，其异化作用类型是需氧型。
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