有关免疫调节剂筛选及评估机体免疫状态的实验Word文档格式.docx

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第二节小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验

基本原理

通过定量地观察巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬情况，反映小鼠巨噬细胞的吞噬能力。

材料和仪器

5％鸡红细胞生理盐水悬液

37℃孵箱

固定液：

1:

1?

丙酮－甲醇溶液

染色液：

4％（V／V）Glemsa一磷酸缓冲液

垫有湿纱布的搪瓷盒

1取体重18一22g的健康小白鼠．随机分成给药组试验组、阴性对照组和阳性对照组。

2　每鼠腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水悬液。

3　8-12小时后,颈推脱臼处死小鼠；

正中剪开腹壁皮肤，经腹膜注入生理盐水2m1，轻轻按揉鼠腹部1分种，然后吸出腹腔洗液lml，分滴于两片载玻片上，放人垫有湿纱布的搪瓷盒内，移置37℃孵箱温育30分钟。

4　以生理盐水漂洗，以除去未粘片的细胞，晾干。

5　1:

丙酮－甲醇溶液固定5分钟。

6　4％（V／V）Glemsa一磷酸缓冲液染色3分钟，用流水冲洗，晾干。

7　结果判定：

油镜下计数巨噬细胞，每片200个按下式计算吞噬百分率和吞噬指数。

吞噬百分率＝

吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数

×

100%

200个巨噬细胞（吞及未吞噬的）

吞噬指数＝

被吞噬的鸡红细胞

÷

2

２００个巨噬细胞

在计数时，应同时观察鸡红细胞被消化的程度，借以判定巨噬细胞吞噬和消化功能．通常分为4级：

Ｉ级：

未消化。

被吞噬的鸡红细胞完整，胞质浅红或浅黄绿色，胞核浅紫红色。

II级；

轻度消化。

胞质浅黄绿色，胞核固缩呈紫蓝色。

III级：

重度消化。

胞质淡染，胞核呈浅灰黄色。

IV级：

完全消化。

巨噬细胞内仅见形态类似鸡红细胞大小的空泡，边缘整齐．胞核隐约可见。

注意事项

1.实验过程中应注意无菌操作。

2.若筛选免疫抑制药，预先可用巨噬细胞诱导剂，在实验前3—4天，腹腔注射％淀粉生理盐水溶液，每鼠。

免疫增强剂多可激活小鼠腹腔巨噬细胞，并增强其吞噬功能一般不再使用巨噬细胞诱导剂。

3.若滴片染色过深，可用1％HCI脱色；

过浅则可复染。

4.每鼠两片的计数应基本一致，若差距过大，应予淘汰。

由小鼠腹腔吸出的液体为出血性渗出液时，不宜使用。

5.必要时用低渗法溶解胞外红细胞，这样容易鉴别细胞内外的鸡红细胞。

6.本法简便．但难于测定吞噬速率及其动力学改变，而且费时。

1.巴德年　1998　当代免疫学技术与应用．北京：

北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，261－263

第三节溶菌酶测定法（光学法）

体液或分泌物中溶菌酶活性可以通过检查其对指定敏感菌株的裂解作用来进行测定，将检品与菌液混合，用分光光度计观察指定时间内透光度改变的百分数反映溶菌酶的活性。

材料与仪器

菌种；

溶壁微球菌（MicrococusLysodeilicus）是从空气中分离出的一种革兰氏阳性球菌，菌落呈黄色，普通培养基上生长良好，１个月传代１次或冻干成菌种保存。

1/15M磷酸盐缓冲盐水（ＰＢＳ）：

　　①1/15M磷酸二氢钾溶液：

磷酸二氢钾,，加蒸馏水至1000ml。

　　②1/15M磷酸氢二钠溶液：

磷酸氢二钠·

，加蒸馏水至1000ml。

③,1/15MPBS：

1/15M磷酸二氢钾溶液73ml,1/15M磷酸氢二钠溶液27ml，氯

化钠混匀，溶解即成。

溶菌酶标准品：

结晶纯品。

5N氢氧化钾：

氢氧化钾56g加蒸馏水至200ml。

分光光度计

1.菌液制备：

将溶壁微球菌接种于普通琼脂斜面上，37℃培养24一36小时．用、1/15MPBS洗下，配成混悬菌液。

用分光光度计波长640nm测定，并调整其浓度达到透光率３０—40％。

2.溶菌酶标准液：

称取溶菌酶标准纯品，用、l／15MPBS配成1000ug/ml原液，放冰箱保存。

临用时再稀释成100、50、25及10ug／ml标准液。

3.检品应根据估计溶菌酶含量作适当稀释．取适当稀释（或不稀释）检品放小试管内。

置37℃水浴箱预热5分钟，再向管内加人预热的菌液混匀，立即记下开始时间，至2分钟时加入1滴5N氢氧化钾停止反应，立即将菌液倒入比色杯内．用640nm滤光板，比色杯测其透光率T1%。

4.另取同样浓度的检品．先加入1滴5N氢氧化钾摇匀，在37℃预热５分钟，再加入经37℃预热的菌液，在同样温度下2分钟后同法测定其透光率Ｔ0。

T１／一Ｔ0％为透光率差值，即溶菌酶所致透光率的变化，从标准曲线上可查得检品中溶菌酶含量。

5.计算：

以各种浓度的溶菌酶标准液代替检品，操作步骤与待检品相同。

以不同浓度标准液测得的透光率差值为纵坐标（对数坐标），溶菌酶浓度为横坐标，在半对数纸上绘制标准曲线。

按检品的T％（2分钟的读数减去零时的读数）查出其对数，由标准曲线上查出稀释的检品中溶菌酶的含量，乘以稀释倍数，即为检品中溶菌酶的含量。

　　注意事项

溶菌酶是一种小分子蛋白质，存在于机体的泪液、唾液、痰、鼻涕、白细胞和血清等。

测定它在体液或分泌物中的含量及其变动情况，可作为侧面了解机体防御功能一个指标。

在选择标本及评价其意义时应予以注意。

刘辉　2000　研究生免疫学教程　大连　大连出版社　260－261　

第四节溶菌酶测定法（平板法）

体液或分泌物中溶菌酶活性可以通过检查其对指定敏感菌株的裂解作用来进行测定，在混有菌液的琼脂疑胶上打孔，将检品放在孔内，一定时间后测定溶菌环的直径。

可反映溶菌酶的活性。

菌种：

1/15M磷酸盐缓冲盐水（ＰＢＳ）

普通琼脂培养基

操作步骤

用72型分光光度计波长640nm测定，并调整其浓度达到透光率３０—40％。

3.加热融化%琼脂粉，待冷却至60-70℃时将溶壁微球菌混入摇匀，使其浓度为1mg/ml，立即倾入已夹好的两玻片中（厚度为4mm）。

4.待琼脂凝固后，以15mm间隔，用打孔器穿钻直径小孔，每孔中加入20ul检样品，并在同一板上加上不同浓度的标准溶菌酶样品，置24-26℃，12-18小时，用测微尺测溶菌环的直径。

5.用半对数纸（以溶菌酶浓度为纵坐标，即对数坐标，溶菌环直径为横坐标）绘制标准曲线。

从线上查出每毫升样品所含溶菌酶的ug数。

在缺乏培养细菌的条件下也可使用干菌粉，将溶壁微球菌24小时培养物用60倍体积蒸馏水洗下，离心沉淀弃上清液，沉积的菌体加约5倍体积的丙酮，用玻棒搅匀，放冰箱内30分钟、取出离心沉淀弃上清液。

按此法用丙酮浸洗3次，再用乙醚洗2次，将菌体放于燥器内过夜，即得干菌粉。

用乳体研碎备用，使用时称干菌粉500mg，放人上述磷酸缓冲液约50ml，如上调整菌液浓度约30一40%.

第二章检测特异性免疫功能的实验

第一节　血清溶血素测定

经绵羊红细胞（SRBC）免疫动物的淋巴细胞可产生抗SRBC抗体（溶血素）。

并释放至外周血。

这种抗体在试管内与SRBC温育．在补体参与下可产生溶血反应．免疫动物血清中溶血素的含量可以通过溶血过程中释放的血红蛋白来测出。

材料与仪器

SRBC保存液（Alsever液）；

葡萄糖，氯化钠，柠檬酸钠，蒸溜水100ml，无菌过滤（Ｇ５漏斗）或8磅10分钟灭菌后备用。

都氏试剂（测血红蛋白用）；

碳酸氢钠，高铁氰化钾，氰化钾，蒸馏水1000ml。

补体：

新鲜豚鼠（至少3只）混合血清经SRBC（10:

1）于4℃吸收30分钟后置-20℃以下备用。

SRBC：

在无菌条件下，自健康成年绵羊外颈静脉取血，置血液于有玻璃珠的三角烧瓶中轻摇10分钟以除去纤维蛋白，加人2倍量的保存液，置4℃冰箱备用。

临用时用生理盐水洗涤3次，经2000rpm10分钟得压积红细胞，再按所需浓度稀释。

操作步骤

1.免疫；

小鼠腹腔注射20％SRBC／天，免疫后第4天去眼球或腹动脉取血，分离血清，将血清稀释（一般500倍以上）后供测定。

2.溶血反应：

反应管内依次加人经稀释的血清lml，5％，10％补体lml．置

3.37℃恒温水浴中保温30分钟，然后移至冰浴中终止反应，1500rpm离心5分钟，取血清液lml加都氏试剂3ml，摇匀放置10分钟，于540nm波长比色读取吸光度。

4.SRBC半数溶血值：

取５％SRBC加都氏液至4ml，比色读取吸光度值，即为实验中所用SRBC半数溶血时的吸光度值。

样品管中数溶血值CH50按下式计算：

每只鼠的血清CH50=

样品的吸光度值

稀释倍数

SRBC半数溶血时的吸光度值

免疫用SRBC浓度可根据不同品系小鼠的敏感度和试验药物的作用强度作调整。

　　刘辉　2000　研究生免疫学教程　大连　大连出版社　261－262　

第二节抗体形成细胞测定

将经SRBC免疫的小鼠脾细胞、SRBC（靶细胞）及补体一起混合于琼脂内，抗体形成细胞分泌的抗体在补体参与下；

使其周围的SRBC溶解形成肉眼可见的溶血空斑，这种溶血空斑数大体上可以反映抗体形成细胞数。

100目尼龙网纱布

Hank'

s液（见附录）

琼脂粉

%台盼蓝

生理盐水

戊二醛

37℃温箱等

1.免疫：

用20％SRBC／只腹腔注射免疫小鼠。

免疫后第4天处死供实验。

2.制备脾细胞悬液：

脱颈处死经SRBC免疫的小鼠，立即剖取脾脏，在冰浴中，将脾置于100目尼龙网纱布上，加少许Hank'

s液，轻轻挤压出脾细胞。

细胞计数时用%台盼蓝染色观察活细胞应在90％以上。

将脾细胞悬液配成107个／ml浓度。

3.制备琼脂底层；

平皿中加人用Hank’s液配成的溶化的1．4％琼脂2—3ml制备琼脂底层。

4.加样：

取脾细胞悬液和5％SRBC各及原补体混合加入保温于45℃水浴的含％琼脂糖的试管中，摇匀后倒人平皿，旋转平皿使混合物均匀平铺于底层琼脂上，凝固后将平皿装人温盒并置37℃温箱中孵育3—4小时后计数PFC。

如需保存，可加入生理盐水或PBS配制的％戊二醛6ml加以固定。

以每106个脾细胞或整个脾脏所含的PFC数表示结果。

　　PFC代表抗体产生细胞的数量，PFC的面积代表抗体的活性，讨论试验意义时应予以注意。

巴德年　1998，当代免疫学技术与应用．北京：

北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，207～208

第三节　特异性淋巴细胞转化试验

基本原理

先用抗原刺激机体，再用该抗原在体外刺激有关淋巴细胞，通过观察淋巴细胞转化情况评定机体的免疫功能。

反应细胞：

取自体内免疫后小鼠淋巴结的T细胞

抗原：

1mg/ml抗原溶于PBS

辅助细胞：

经照射或丝裂霉素C处理后同系小鼠脾细胞（或非–T脾细胞）

Freunds完全佐剂

96孔圆底或平底细胞培养板

3H-标记甲基胸腺嘧啶

100%乙醇

闪烁液

多孔收集器

玻璃纤维滤纸

液体闪烁计数仪

液闪管等

【操作步骤】

⒈免疫小鼠：

制备抗原水溶液与Freunds完全佐剂的混悬液。

若为引起淋巴结细胞的免疫应答，可经足垫免疫；

若主要引起脾细胞免疫应答，可经腹腔免疫。

皮下免疫后再经尾静脉免疫也是一条有效的免疫途径。

细胞抗原可经腹腔免疫。

需免疫2-3周才可进行体外试验。

⒉将抗原做4倍或10倍稀释，每孔加入30ul蛋白质抗原。

对照孔加入30ul培养基。

⒊无菌取免疫后小鼠淋巴结和未免疫同系小鼠淋巴结，制成细胞悬液，并计数。

⒋每孔加入100ul反应细胞。

反应细胞最好为纯化后T细胞，否则可能会因非抗原特异细胞的增殖反应使对照值增高。

若使用未分离的淋巴结细胞，每孔可加入1-2×

106细胞。

⒌每孔加入100ul5×

106辅助细胞。

⒍37℃，5%CO2培养4-5天。

结束培养前6-18h每孔加入胸腺嘧啶。

⒎用细胞收集器将细胞收集在滤纸上，反复（至少10次）充吸培养孔，以保证DNA留在滤纸上，而未掺入的[3H]胸腺嘧啶被完全除去。

100%乙醇处理以助于滤纸干燥。

或静置过夜。

⒏　将干燥的滤纸片加入液闪瓶，每瓶含5ml闪烁液。

⒐　液闪仪计数cpm值。

注意事项

⒈　多数情况下，1×

106/ml细胞浓度对多数刺激能产生良好的增殖反应。

否则需预先滴定出合适的细胞浓度。

当细胞浓度低时，改用96孔圆底培养板能提高增殖反应。

⒉细胞在培养前应具有良好的活力。

⒊[3H]-胸腺嘧啶掺入时间长，会提高实验的重复性。

每批实验时，应固定掺入时间和掺入量。

叶应妩　1997　全国临床检验操作规程　南京：

东南大学出版社　379-381

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（张璐　刘辉）

第三章有关免疫实验的动物模型

第一节免疫功能低下动物模型

　　基本原理

　　利用淋巴细胞敏感的细胞毒药物抑制或杀伤淋巴细胞，使机体免疫功能低下。

试剂与器材

环磷酰胺

氢化可的松

　　方法一：

健康小鼠，每鼠皮下注射环磷酰胺：

80－100mg/kg，5天后免疫功能显着降低。

方法二：

健康小鼠，每鼠每天皮下注射氢化可的松：

50－100mg/kg，6－8天后免疫功能显着受抑。

1.必须设对照组，随机分配。

在用免疫功能障碍的动模型时，亦应加设正常动物对照组，以检验模型是否成功。

2.由于免疫反应与基因类型有关，应尽可能采用纯系动物，并控制鼠龄、性别和体重，以减少个体差异。

余传霖　1998，现代医学免疫学．上海：

上海医科大学出版社，1202－1214

第二节　大鼠同种被动皮肤过敏反应

将致敏大鼠的血清（内含丰富的lgE抗体）皮内注射于正常大鼠腹壁或背部，每点形成一皮丘。

IgE与局部皮肤肥大细胞的FC受体结合，使之被动致敏。

当抗原攻击时，引起局部肥大细胞释放过敏介质，从而使局部血管的通透性增加，注入伊文思蓝，可渗出于皮丘内，形成一个蓝斑。

根据蓝斑范围或深浅程度，判定血管通透性变化，以反映皮肤过敏反应的程度。

试剂与仪器

天花粉

4％氢氧化铝

5％伊文思蓝溶液（内含天花粉1mg）

1.抗血清制备：

取体重90—100g健康大鼠，天花粉以4％氢氧化铝凝胶配成5mg／ml的混悬液，给大鼠4个足跖注射各，共。

于致敏后10－14天，处死动物采血，血经低速离心，分离血清，置冰箱备用。

2.被动皮肤致敏及抗原攻击：

另取体重150～200g健康大鼠，在乙醚麻醉下剪去背部的毛，将稀释的抗血清（稀释度可在I：

20一1：

80）皮内注射于鼠背部，每一稀释度注射二点。

每点，至少注射两个稀释度。

48小时后进行抗原攻击，静脉注射lml、％伊文思蓝溶液（内含天花粉1mg）。

20分钟后断头处死动物，翻转背部皮肤，测定蓝色反应斑的直径大小。

1.本法是抗

型变态反应药物常用的筛选方法，方法简便，筛选的结果与临床效果基本吻合。

2.注意假阳性的发生，有些药物可以降低血管通透性，也能得到阳性结果，但不一定影响过敏反应，应予排除。

3.为使结果更加客观，可剪下蓝斑皮肤，每点以5ml丙酮生理盐水溶液（3:

7V／V），浸泡48小时，离心，取出上清液，以590nm测定光密度。

PCA抑制百分率可用下式计算：

抑制百分率＝

对照组蓝斑直径或光密度一用药组蓝斑直径或光密度

100%

对照组蓝斑直径或光密度

　　刘辉　2000　研究生免疫学教程　大连　大连出版社　266－267

第三节　Ⅱ型变态反应动物模型

将这种抗体注射于正常动物的皮内组织，在补体参与下，可引起皮肤血管炎，使血管通透性增加。

皮肤血管炎反应轻重可以通过血管通透性来反映。

亦称Forssmam皮肤血管炎反应。

抗SRBC血清制备：

将109SRBC混悬于lml磷酸盐缓冲液，给正常兔静脉注射，隔天l次，共10次。

于最后一次注射后14天，收集兔血清。

本血清即为抗SRBC血清．亦即溶血素。

抗血清接种及观察：

取体重200—300g健康豚鼠，剪去背部，将1：

8以生理盐水稀释的抗血清皮内注射于背部，每点。

可根据实验要求，注射多个稀释度的抗血清，每个稀释度至少注射两点。

24小时后可见注射局部有炎症反应。

静脉注射％伊文思蓝溶液lrnl，半小时后注射局部有一明显的蓝斑。

处死动物，测定皮肤蓝斑的直径。

　　为使结果客观，可用比色法测定蓝斑中伊文思蓝的含量，每点以5ml丙酮生理盐水溶液（3:

可用下式计算抑制百分率：

　　刘辉　2000　研究生免疫学教程　大连　大连出版社　268－269　

第四节III型变态反应动物模型

本模型的形成需要有抗原的持续存在，将抗原物质反复注射，抗原与相应抗体结合形成游离的免疫复合物，在一定条件下这种复合物沉积在血管壁基底膜或组织间隙，通过激活补体、中性粒细胞或血小板，造成沉积部位炎症变化。

亦称Arthus反应。

硫酸钠

卵白蛋

Freund'

s完全佐剂（有商品出售）

⒈　取体重l—健康免，雌雄不拘。

⒉将经3次重结晶的卵白蛋白乳化于Freund'

s完全佐剂中，乳化必需充分。

⒊每周肌肉注射lml，共4次。

⒋最后1次注射后第9天，背部剪毛，第１０天背部皮内注射10％卵白蛋白，每点注射量为。

⒌抗原攻击后2、3、4、6、8、12、24小时观察每点局部皮肤红肿的最大直径与反应的程度，求其平均值。

反应程度标准分级；

＋＋＋：

2或5小时明显充血、出血，呈融合状；

24小时明显出血性变色。

＋＋：

2或5小时中度充血、出血，呈斑块状；

24小时中度出血性变色。

十：

2或5小时轻度充血、出血；

24小时轻度出血性变色。

一：

2小时或24小时无反应。

1.本模型形成的关键在于卵白蛋白的抗原性及其与Freund'

s完全佐剂乳化程度，必须采用抗原性强的卵白蛋白，并与Freund'

s完全佐剂应乳化充分。

2.在药量不足时，可以大鼠代替兔。

大鼠Arthus反应形成，所需肌肉注射卵白蛋白的次数比兔多，每鼠每周肌肉注射共６次，前３次为卵白蛋白－Freund'

s完全佐剂，后３次卵白蛋白－Freund'

s不完全佐剂。

但大鼠Arthus反应不如兔严重。

3.受试药物可在抗原攻击前给予，其给药途径与给药时间由受试药物的药效学与药动学特点决定。

第五节二硝基氟苯诱导小鼠的迟发型变态反应

二硝基氟苯（dinitrofluorobenzene,DNEB）是一种半抗原，将其溶液涂抹腹壁皮肤后，与皮肤蛋白结合成完全抗原，由此刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。

4－7天后将其再次涂抹于皮肤，可使局部产生迟发型变态反应（水肿）。