电子显微镜与超薄切片技术Word格式文档下载.docx
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其中d为分辨率，l为入射光的波长，n为透镜和物体间介质的折射系数，a为物体与物镜间所成夹角的二分之一，0.612为常数
2）放大倍率显微镜的放大倍率与其分辨力密切相关，它是人眼分辨力与显微镜分辨力之比，亦即：
显微镜的放大倍率（m）=人眼分辨力d/显微镜分辨力d。
人眼的分辨力为0.2mm，所以：
光镜的放大倍率（m）=0.2mm/0.2mm=1,000倍；
电镜的放大倍率（m）=0.2mm/0.2nm=1,000,000倍（100万×
）；
当电镜的分辨力为0.5nm时，其m=0.2mm/0.5nm=400,000倍（40万×
）。
从以上放大倍率的推算中可以看出，电镜分辨力的高低是评价电镜性能的重要指标。
3）电子枪发射电子束的装置为电子枪。
其由上到下有阴极、栅极和阳极，在高真空的镜筒内好象三级电子管。
阴极是金属钨做成的灯丝，给钨丝加上电流，烧到高温，钨丝就放出大量自由电子，这就是热电子发射。
在高真空的环境下，受上万伏加速电压的作用和下面阳极的吸引，大量自由电子向下发射，形成电子束，电子束就相当于光镜的可见光源。
4.透射电子显微镜的基本结构
透射电镜主要由电子光学系统、真空系统、电器系统、辅助系统四个部分组成。
1）电子光学系统
电子光学系统是透射电镜的主体，亦称镜筒。
包括：
电子枪：
电镜是以电子枪作为光源的，通常是在高真空中把钨丝加热，发射电子并加速到达样品；
聚光镜：
其作用是把电子枪发射的光源会聚到下面的样品平面上。
高性能电镜采用双聚光镜，目的在于提供最大亮度的电子束；
调控系统：
调节电子枪、透镜等各部件之间的对中合轴、调节照明亮度、放大倍率及聚焦等；
样品室：
样品室位于聚光镜和物镜之间，主要结构为：
样品台、样品移动控制杆、冷阱及样品转换装置；
成像放大系统：
由物镜、一至三个中间镜和两个投影镜组成，可通过调节中间镜和投影镜的电流来改变不同的放大倍数，改变物镜电流对图像进行聚焦；
观察记录系统：
电子图像在投影镜下方的观察室荧光屏上转化为可见图像。
当需要记录时，用屏下的照像机将电子图像摄下保留。
2）真空系统
真空是透射电镜工作的首要和必备条件，目的是防止电子散射、样品污染、提高灯丝寿命。
真空系统的作用，是将镜筒中的空气和其他气体尽可能干净地排出去，使整个电子光学系统内部始终都保持在高真空中，其真空度至少要求达到10-5托Torr（Torr=1/760大气压=1毫米汞柱）以上。
这就要求在开启电镜、更换样品及更换底片等操作完成后，一定要按一定的顺序将真空度抽提达到要求后方可进行下一步操作。
主要包括：
机械泵和扩散泵等抽气设备，真空检测装置和各种不同功能的阀门及控制系统。
3）电器系统
电器系统是电镜成像的另一个重要部分。
由总电源稳压电路、电压及灯丝电路、透镜电路、真空电路、照相电路、安全控制电路等组成。
整机消耗功率不大，但电压稳定要求高。
4）辅助系统
主要是水冷系统，帮助冷却电子透镜和油扩散泵。
（图：
H-7500透射电镜外观结构模式图）
5、.透射电镜的操作（略）：
在电镜室见习时进行讲解。
二.超薄切片技术
透射式电子显微镜电子束的穿透能力较弱，大多数标本无法直接在电镜下进行观察，必须切成厚度为10-100nm的薄片，这种切片称为超薄切片。
超薄切片技术是透射电镜生物样品制备最基本的技术。
1.超薄切片的基本要求：
1）细胞的超微结构得到良好的保存，没有明显的人工假象；
2）切片厚度一般为50nm左右；
3）切片的包埋介质不变形、不分解、不升华，可耐受电子束的照射；
4）切片平展均匀，没有刀痕、皱褶、震颤及染色剂的沉淀污染；
5）切片染色后，具有良好的反差并可获得清晰的图像。
2、超薄切片制备技术过程：
包括取材、固定、清洗、脱水、浸透、包埋、切片及染色等步骤。
1）取材
从动植物机体上或从细胞及微生物的培养物中取得所需材料的操作过程叫取材。
取材是获得电镜优良图像的第一个关键步骤。
取材总的要领是快、小、准、轻、冷。
（1）快：
标本要新鲜。
不管是从麻醉或处死动物身上取材，还是临床手术取材，都应注意保持样品的微细结构，使其最大限度的近于生活状态。
所以一定要目标明确，操作迅速，而且使样品必须在离体半分钟或最多2分钟内浸入固定液，以免时间过长，出现细胞自溶。
（2）小：
所取标本体积要小。
一般用于电镜标本固定的固定剂穿透力都较弱，固定速度慢，所以要求组织块体积一般不超过1mm3，否则组织块中心部分得不到充分固定，易出现死后变化。
（3）准：
取材部位要准。
由于电镜样品取材标本体积极小，必然有一定的局限性。
所以取材的部位一定要准确可靠，同时还应注意材料的方向性，例如选取肌组织时，就要考虑肌纤维在将来切片时是纵断还是横断；
其它组织也要考虑到定位和定向的问题。
（4）轻：
是指一切操作都要动作轻柔，要避免对组织的牵拉和挤压，同时要注意用锋利的器械，防止组织结构的人工损伤性变化。
（5）冷：
要求在0-4℃的低温条件下取材，所用容器、器械和固定剂均需预冷（0~4℃），以降低自溶酶活性，减少组织自溶。
具体操作方法：
将所需器官用锋利的解剖剪刀取一小块组织，迅速放在滴有预冷的戊二醛固定液的牙科蜡板上，以一分为二的双面保险刀片把样品切割成1mm3的小块，迅速投入预冷的固定液小瓶内，并在小瓶上贴好标签。
对于胚胎及脑等柔软易碎组织，可切成稍大的组织小块，放入固定液内15分钟左右，再细切为1mm3的组织块固定。
对于血液及其他细胞悬浮液，不宜直接固定，可在取材后将其放入离心管内，以2000~4000转/分的离心速度，离心10~15分钟，待样品在离心管底部集结成块状以后，弃去上清液，再滴入固定液稍加固定，然后用刮匙将样品取出并割成小块，再进行固定。
2）固定
（1）固定的目的
是在分子水平上使被研究的组织和细胞，如同生活时一样，把结构的每一细节精确地保存下来，即设法使其保持接近细胞的生活状态，并尽可能地减少细胞的死后变化，使细胞及其细胞器的精细结构完好无损地得以保存。
（2）固定液的种类、配方及其特点
戊二醛（Glutaralodehyde,CHO（CH6）3CHO）是电镜样品制备中最常用的固定剂之一。
市售戊二醛一般为25%的水溶液，pH为4.0~5.0，应避光保存在4℃环境中，否则易发生聚合，pH下降，影响固定效果。
戊二醛作为生物样品的固定剂，具有以下优点：
①渗入组织的速度较快，常用作前固定剂；
②对组织内某些酶的活性保存较好，适用于电镜细胞化学研究；
③与蛋白质之间的反应较快，能较好地保存蛋白质的结构；
④对细胞内微管及滑面内质网、线粒体等膜性结构保存较好；
可以较好地固定和保存组织内的糖原。
戊二醛作为生物样品固定剂的主要缺点：
①没有电子染色作用，单独用它固定的生物样品电子反差不好；
②脂类及其他一些微细结构，在脱水时易被提取出来。
③对pH（7.0~7.4）和渗透压要求较高。
戊二醛固定液一般用磷酸缓冲液或二甲砷酸钠缓冲液配制。
具体配法如下表：
表10.1M磷酸缓冲戊二醛的配制
戊二醛最终浓度（%）
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
4.0
5.0
0.2M磷酸缓冲液（ml）
50
25%戊二醛（ml）
4
6
8
10
12
16
20
加双蒸水至（ml）
100
表20.1M二甲砷酸钠缓冲液戊二醛的配制
0.2M二甲砷酸钠缓冲液（ml）
四氧化锇（又称锇酸，OsO4）是电镜样品制备中另一种常用的固定剂，为一淡黄色具有强烈刺激性的晶体，为强氧化剂，常用其1%的溶液进行电镜样品的后固定。
四氧化锇固定剂优点为：
①OsO4对蛋白质、肽及氨基酸等各种结构成分起反应，在蛋白质分子之间形成交联，使蛋白质的分子固定；
②与不饱合脂肪酸反应，使脂肪酸得以固定，是唯一能保存脂类的固定剂；
③有“电子染色”作用，提供一定的图像反差；
它还能固定脂蛋白，使生物膜结构的主要成分磷脂蛋白稳定；
对缓冲液要求不甚严格。
四氧化锇固定剂的缺点是：
①四氧化锇对糖类和天然DNA、RNA保存作用极差，因此单独用四氧化锇固定时，大部分碳水化合物包括糖原皆可被溶掉。
②其分子较大，渗透能力较弱，在1~1.5小时内，仅渗透0.1~0.5mm，因此在取材时应注意样品大小不超过0.5~1mm3。
四氧化锇有强烈的挥发性，对皮肤和粘膜有损伤作用，配制时应注意通风。
锇酸溶液最好在使用前配制，其正确的配制方法是：
用砂轮在装有四氧化锇晶体的玻璃管上划一深痕，用浓清洁液泡洗，再用双蒸水洗净，将玻璃管放入洁净的磨口瓶内，用力将其震碎，再迅速倒入量好的双蒸水，适当震荡，溶解后即为2%贮存液，用时加等量0.2M磷酸缓冲液或0.2M二甲砷酸缓冲液（pH7.2~7.4）。
（3）常用的固定方法为戊二醛-锇酸双重固定法
本固定法可充分发挥戊二醛与四氧化锇二固定剂的优点，有利于保存细胞内各种微细结构，所以现在被普遍应用。
其操作步骤是：
前固定：
将生物样品先浸入预冷（4℃）的2%~4%戊二醛内固定1~2小时或更长时间→清洗：
为了彻底清除戊二醛的残余，避免与锇酸之间出现不必要的反应，前固定后必须经缓冲液反复清洗。
一般0.6~2小时（中间更换数次）或漂洗过夜→后固定：
1%锇酸后固定1.5~2小时。
固定液的用量以能淹没样品为准，约为样品的40倍，固定液过少，组织固定不充分，固定液过多，则又造成浪费。
样品经戊二醛固定后呈淡黄色，再经锇酸固定后则变成黑色。
3）脱水
由于所用包埋剂是非水溶性的，必须将细胞中的游离水彻底清除后，非水溶性的包埋剂才能渗入细胞，所以，样品必须脱水完全。
常用的脱水剂是乙醇和丙酮，它们既能与水混溶又能溶于包埋剂。
脱水步骤：
乙醇或丙酮，从50%→70%→80%→90%→100%（2次），每步10~15分钟，梯度上升进行，如果当天不能完成，样品则应保存于70%脱水剂中，一般认为70%的浓度时所引起的组织块体积变化最小。
4）浸透与包埋
（1）浸透
浸透的目的是使包埋剂逐步透入组织细胞，使细胞内外所有空隙都被包埋剂所填充。
浸透的具体过程为：
脱水后样品迅速移入丙酮、包埋剂等量混合液，30分钟或数小时，然后入纯包埋剂数小时或过夜，最后进行包埋。
（2）包埋
把浸透好的样品放在适当的模具中，灌上包埋剂，经过加温使包埋剂逐渐聚合，制成包埋块。
这样，样品即获得坚固的支持，并能经受超薄切片的切割操作。
理想的包埋剂应具有粘度低，容易浸透，聚合均匀，聚合后体积收缩小，能与脱水剂互溶，能耐受电子束的轰击，对细胞成分提取少，细胞微细结构保存良好；
有良好的切割性能，有适当的反差，对人体无害。
当前采用最多的包埋剂是环氧树脂Epon812，其对组织损伤小，耐受电子束的轰击且具有良好的切割性能。
常用的固化剂有十二烷基琥珀酸酐（DDSA）和六甲酸酐（MNA）等，调节二者的比例，可改变包埋块的硬度。
常用的催化剂有2.4.6-三（二甲氨基甲基苯酚）简称DMP-30，其主要作用是可以催化聚合反应。
Epon812包埋剂配方：
甲液：
Epon81210ml，DDSA16ml;
乙液：
Epon81210ml,MNA8.9ml。
上述二液配制后需分别贮存，使用时可按不同的硬度要求，量取不同比例予以混合。
一般冬春季用甲：
乙=1：
4，夏季用1：
9。
乙液比例越大，包埋块越硬。
待上述二液混匀后，再按1.5~2%的体积比，滴加入DMP-30，并充分搅拌。
常用的包埋模具是药用胶囊、特制锥形薄塑料管或定向橡胶包埋板。
包埋时用牙签将组织块准确放入已干燥的胶囊或塑料管底部正中，注满已充分混匀的包埋剂；
需定向包埋的组织则将样品按所需方向放入包埋板的尖端。
将上述胶囊或包埋板放入恒温箱内加温聚合，35℃（12小时），45℃（12小时），60℃（24小时）。
5）切片前准备
（1）铜网超薄切片需捞在特制的载网上才能在电镜下观察。
常用200~300目，直径3mm的铜网。
新铜网使用前用乙醇或丙酮清洗干燥即可；
旧铜网需经酸洗或超声波清洗。
（2）支持膜的制备：
清洗干净的铜网，其表面需制备一层透明而无结构的支持膜，以便承载有关的切片样品。
此膜宜厚薄适中，过薄时样品易有漂移或被电子束打破，过厚时则降低图像的分辨力，一般厚度为20nm。
用做支持膜的原料有Formvar、火棉胶等。
其制备方法为：
配制0.3%的Formvar二氯乙烯溶液或1-3%的火棉胶醋酸异戊酯溶液。
取光洁干净的玻璃片，在上述溶液中静置片刻，垂直取出后室温下垂直晾干，在载玻片上便形成一层薄膜。
用刀片或眼科镊子在膜的四周均匀地刻划一矩形。
再将载玻片略倾斜匀速地伸入盛满蒸馏水的烧杯中，薄膜即漂浮在水面上，用镊子将数个干净的铜网糙面向下轻轻放在膜的中央部分，然后用一小片略大于膜的滤纸平放在膜上，待滤纸浸湿后用镊子将滤纸轻轻提出水面，将滤纸铜网朝上放在平皿中，烘干备用。
（3）包埋块的修整制作好的包埋块，应将其尖端修成适当形状和大小，除去组织周围多余的包埋介质。
使包埋于其中的组织露于包埋块的尖端，才能用于切片。
包埋块的顶端表面形状，一般修成梯形或方形，面积约1mm2，其四周则修成锥体状。
（4）切片刀切片刀的制备与选择是超薄切片成败的关键之一。
超薄切片使用的刀有两种，即玻璃刀和钻石刀。
（1）玻璃刀：
玻璃刀制作简便、价廉，但刀刃脆不耐用，而且不能切割硬质材料。
制作玻璃刀所用的玻璃，必须为不含杂质的硬质玻璃，其厚度要求为5~6.5mm。
现多用专门的制刀机制刀。
制刀的具体操作步骤可按制刀机使用说明进行。
一般选用45°
刀。
制好玻璃刀后，还要在玻璃刀的背面（斜面）用胶布或塑料槽作一个水槽，并用石蜡封好。
（2）钻石刀：
能切割特别硬的组织，可获得比用玻璃刀质量好得多的较大的连续切片。
钻石刀质地坚硬、经久耐用，但其价格昂贵，所以钻石刀的应用受到一定限制。
6）半薄切片对于某些必须限定方向或部位的结构，在进行超薄切片前需先进行半薄切片，光镜下检查，才可比较准确地选择超薄切片的部位，以提高电镜观察效果。
首先在超薄切片机上用玻璃刀制取0.5~2.0mm半薄切片，将其移至滴有蒸馏水的玻片上，60~80℃恒温板上干燥，使切片展平粘牢。
然后在切片上滴加0.5%甲苯胺蓝溶液（用0.1M磷酸缓冲液配制，pH7.2~7.4），边加热边染色，时间2~3分钟；
最后，用蒸馏水反复清洗并去除多余染液，干燥封片，光镜下观察并定位。
7）超薄切片
一般透射电镜观察样品时，电子束无法穿过0.1mm以上的切片，所以需将样品切成50~70nm的薄片才能观察。
与光镜观察的3~7mm切片对比而言，常将透射电镜的切片称为超薄切片。
制备此类切片的切片机称超薄切片机。
（1）超薄切片机目前超薄切片机的型号很多，按其设计的推进原理，可将超薄切片机分为机械推进式和热膨胀推进式两类。
不同型号的超薄切片机虽然操作方式各不相同，但其切片原理都基本相同，所有切片机在切片过程中，都是使一个装有样品块的活动臂上下运动并通过刀刃，在活动臂每次下降切片之前均对着刀刃作微小的推进，这样便使一极薄的切片从样品块表面被切割下来。
刀上有一装有液体的小水槽，脱落下来的切片悬浮在小水槽的液面上。
所有超薄切片机都有三种进尺范围，即粗调、微进尺和超微进尺，借以调节样品块与刀刃间的距离及切片的厚度，同时还可保证机器的准确线性运动并具有良好的重复性能。
在切片机上都附有一个双目显微镜和一个日光灯，用于选择刀口、刀刃与样品块对准和观察切片的情况；
还有一个聚光灯，专门用以检查刀刃的质量。
（2）超薄切片的基本步骤
安装包埋块将修好的包埋块夹在样品夹中，顶端露出约2mm；
安放玻璃刀将带有水槽的玻璃刀放在刀夹中夹紧；
调整组织块与玻璃刀的位置：
用粗、中调进刀，使刀尽量接近组织块的切面；
调节定向头使组织块切面与刀刃平行；
水平移动刀台，使刀刃平直无缺口处对准切面；
调节水槽液面：
用注射器向水槽中加入蒸馏水，直至液面出现最大亮斑，以便看清切片的干涉颜色；
选定切片速度玻璃刀超薄切片的切片速度通常为2~5mm/秒。
包埋块偏软时应选择较高的切片速度，包埋块较硬时则选较慢的切速；
切片厚度一般用切片的干涉色作为确定切片厚度的近似指标。
暗灰色<
40nm，灰色40~50nm，银色50~70nm，金色70~90nm，紫色>
90nm。
较薄的切片，有较高的分辨率，但反差较差；
较厚的切片，有较好的反差，但分辨率较低；
一般认为，银白色的切片较为理想，既有足够的分辨率，又有良好的反差；
切片收集也称捞片。
飘浮在水槽液面上的切片，需捞于铜网上才适于在电镜下观察。
用一根睫毛针，在立体显微镜下将水面上的切片带轻轻拨成几段，再以专用镊子夹住铜网边缘，使带有支持膜的一面对准切片轻轻沾取，即可将切片沾附于铜网之上。
用滤纸角吸掉铜网上多余的水分，放入培养皿的滤纸上等待染色。
8）超薄切片的染色
超薄切片需经染色后，才能在电镜下显示出清晰的结构图像。
但这种染色是利用重金属盐与细胞不同结构呈不同程度的结合或吸附，从而造成这些细胞结构对电子散射能力的差异而获得的。
所以这种染色又称“电子染色”。
由于对细胞不同结构具有不同的散射能力，致使散射电子多的结构在荧光屏上图像暗，称为电子密度高；
散射电子少的结构，透过电子多，从而在荧光屏上图像浅亮，称电子密度低。
常用的电子染色剂为醋酸双氧铀和铅盐。
（1）醋酸双氧铀可与细胞内大多数分子结合，以提高核酸、蛋白质和结缔组织纤维成分的反差为主，对膜的染色效果较差。
一般用其饱和液，配制时可取醋酸铀2g加入50~
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