微生物实验操作规范Word下载.docx

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蒸馏水1000ml

3.NutrientAgar（营养肉汁琼脂）

Pepton（蛋白胨）5gBeefextract（牛肉膏）30g

NaCl5gAgar（琼脂）15g

Distilledwater（蒸馏水）Adjust（调）pHto7.0-7.2

4.RS

L-盐酸鸟氨酸6.5g氯化钠5.0g

L-盐酸赖氨酸5.0g脱氧胆酸钠1.0g

L-盐酸半胱氨酸0.3g酵母提取物3.0g

麦芽糖3.5g溴麝香草酚蓝0.03g

硫代硫酸钠6.8g新生毒素0.005g

枸橼酸铁铵0.8g琼脂12.5g

蒸馏水1000mL

5.麦康凯

蛋白胨20.0g乳糖10.0g

牛胆盐5.0g氯化钠5.0g

中性红0.03g琼脂14.0g

pH6.9-7.3

几种试剂的制备

波恩试剂：

75%饱和苦味酸25%福尔马林5%冰乙酸

细菌的分离

1．待检材料的处理

无菌采集的病料不经处理可直接用于分离；

污染较严重的病料，接种前必须处理后方可进行分离培养。

（1）加热处理法

当怀疑病原菌为芽胞菌时，可加入5-10倍灭菌生理盐水研磨（液体病料除外），75℃水浴30min（或80℃15-20min），可杀死细菌繁殖体（包括杂菌及病原菌）；

然后将处理过的病料接种到适当的培养基上。

（2）接种易感动物

把病料接种易感动物，待其发病死亡后，取其血液或组织器官，接种到培养基上。

利用此方法不但可以从污染的材料中分离出病原菌，而且还可以确定病原菌的毒力。

（3）化学药品处理

有些化学药品对某些细菌有极强的抑制力，而对另一些细菌则没有抑制作用或很小。

因此可将适宜的化学药品加入培养基中。

如龙胆紫则可抑制许多G＋菌的繁殖，有利于G－菌的分离培养；

2．平板划线分离培养法

（1）培养基平板的准备

取普通琼脂培养基或含有特殊成分的琼脂培养基，融化并让其冷却至50℃左右，倾入灭菌平皿中，每个平皿约15mL，使其分布均匀，冷却凝固后即为固体平板培养基。

（2）各种物品的准备

取出待检病料，置于工作台上；

接种前准备好酒精灯、接种环、火柴、酒精棉球、试管架等。

如有超净工作台，应先打开通风机，过滤除尘，如有紫外线灯应同时打开，10-15min后可开始工作。

不论在桌面上还是在超净工作台上接种，都要事先作好准备工作，把所用的物品器械摆好。

（3）平板划线

以左手持平板，中指、无名指和小指托着平板底,拇指和食指打开上盖，使盖与底成30o角，以便划线。

右手握接种环，先灭菌铂丝部分，待丝烧红后，再于火焰上灭菌金属棒部分。

把接种环上的病料涂在培养基一侧，一般作5-8次划线。

将环上的多余细菌材料烧掉后，从第1次划线引出第2次划线；

再从第2次划线引出第3次划线，如此反复3-4次划线后，即可把整个平板表面划满，注意每一次划线只能与上一次划线重叠，这样就可在最后的1-2次划线上出现多量的单个菌落，以便进行纯培养。

（4）培养物的观察

病料在接种培养基后，经过一段时间，应取出来检查其生长状况。

首先用肉眼检查有无细菌生长；

若有，则需进一步检查菌落是否纯一。

当从临床病料中分离细菌时：

多数情况下，沿划线生长较多的菌落，是待检病原菌的可能性较大；

少数零散分布或不在划线上生长的菌落，多为杂菌。

为慎重起见，可挑选若干个可疑菌落分别进行鉴定。

3．厌氧菌的分离培养法

通常使用物理去氧、化学去氧和生物去氧，实验室常用：

厌氧培养箱、厌氧肉汤

4．细菌的纯培养与移植接种

分离培养的目的就是要获得纯培养。

细菌的纯培养就是只含一种细菌的培养物，最理想的纯培养是一个细菌的后代。

细菌的移植接种就是把某种细菌材料移种到一个新的培养基上，使它在其上生长。

接种

接种标本是细菌实验室的一项基本操作技能，目的是使细菌能得到充分的生长和能分离出单个菌落获得纯培养而供分析鉴定只用，所以

此项技术的操作应按以下方式进行：

1.左手的操作要点：

左手负责持平板、试管、烧瓶等物品，操作中，左手应尽量减少摆动，否则，不利于保持物品的无菌状态。

1.1左手持物品时，最好固定在一个空间方位上，以避免因移动使空气中的细菌进入器皿，造成随机性污染。

1.2所持器皿其开口尽量避免向上，持平皿时，可以让平板的表面与桌面尽量垂直，试管与烧瓶也可倾斜。

当从标本器皿或平板上挑去接种物或菌落后应立即塞上试管塞或扣上平皿，随即接种标本。

2.右手的操作要点：

握有接种工具的右手，将接种环沿伸到标本之前应作好接种环用酒精灯消毒的工作，待冷却后到容器中挑取接种物，在挑去标本后，其接种工具应尽量避免接触试管及试管口等。

随后将接种物在培养基上分离划线。

3.接种的基本步骤：

3.1右手持接种工具，在火焰上灼烧3次灭菌

3.2左手持原代培养物的平皿或试管

3.3用接种环挑去适量标本或细菌，纯化细菌应从原代培养物上挑取单个菌落。

从液体培养基中取菌，只需将接种环在培养液中蘸取一环即可。

3.4平板划线：

接种环，先灭菌铂丝部分，待丝烧红后，再于火焰上灭菌金属棒部分。

3.5接种后，应在火焰上反复灼烧接种工具并作一定的编号记录。

细菌的生化试验

1、氧化型与发酵型（O/F）的测定

试验方法：

将菌液分别注射到两个O/F生化反应管中

加lmL灭菌的液状石蜡油到一个O/F管作发酵试验

37℃下孵育24h

结果判定：

①只在没有覆盖石蜡油的一管发酵糖产酸或产酸产气者属氧化型（或呼吸型）

②两管均发酵糖产酸或产酸产气者为发酵型

2.糖、醇类生化管

将菌液分别注射到糖发酵生化反应管中

变黄色阳性

变紫色阴性

灭菌

①干热灭菌法

干热灭菌是在电热干燥箱内利用高温干燥空气（160℃~170℃）进行灭菌，它是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌目的。

此法适用于玻璃器皿如移液管、试管和培养皿的灭菌。

培养基、橡胶制品、塑料制品不能采用干热灭菌。

细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。

因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160℃~170℃），时间长（1~2h）。

但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。

干热灭菌使用的是电热干燥箱（干燥箱）。

具体操作步骤如下：

1.装入待灭菌物品：

将包好的待灭菌物品放入电热干燥箱内，关好箱门。

堆积时要留有空隙，物品不要摆放得太挤，以免妨碍空气流通，灭菌物品不要接触电热干燥箱内壁的铁板、温度探头，以防包装纸烤焦起火。

2.升温：

接通电源，打开开关，适当打开电热干燥箱顶部的排气孔，旋动恒温调节器，使温度逐步上升。

当温度升至100℃时，关闭排气孔。

在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示电热干燥箱内停止加温，此时如果还未达到所需的160℃~170℃，则需要转动温度调节器使红灯亮，如此反复调节，直至达到所需的温度。

3.恒温：

当温度升到160℃~170℃时，借助恒温调节器的自动控制，保持此温度2h。

干热灭菌过程中，严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。

4.降温：

切断电源，自然降温。

5.开箱取物：

待电热干燥箱内温度降到60℃以下后，才能打开箱门，取出灭菌物品。

同时，应将温度调节旋钮调到零点，并打开排气孔。

电热干燥箱内温度未降到60℃以前，切勿自行打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。

②高压蒸汽灭菌

高压蒸汽灭菌是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内，在一定的压力下保持15~30分钟进行灭菌。

此法适用于培养基、无菌水、工作服等物品的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。

将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅夹套间的水沸腾而产生蒸汽。

待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中排尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，获得高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

在相同的温度下，湿热灭菌的效果好于干热灭菌。

有三点原因：

在湿热灭菌中菌体吸收水分，蛋白质容易凝固变性，蛋白质随着含水量的增加，所需凝固温度降低；

湿热灭菌中蒸汽的穿透力比干燥空气大；

蒸汽在被灭菌物体表面凝结，释放出大量的汽化潜热，能迅速提高灭菌物体表面的温度，从而增加灭菌效力。

实验室常用的灭菌锅有非自控手提式高压蒸汽灭菌锅和自控式灭菌锅，其结构和工作原理是相同的。

本实验介绍的是非自控手提式高压蒸汽灭菌锅，自控式灭菌锅的使用可参考厂家说明书。

1.加水：

首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面没过加热蛇管，与三角搁架相平为宜。

切勿忘记检查水位，加水量过少，灭菌锅会发生烧干引起炸裂事故。

2.装料：

放回内层锅，并装入待灭菌的物品。

注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。

装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包扎的纸而透入棉塞。

3.加盖：

将盖上与排气孔相连的排气软管插入内层锅的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，然后以对称方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气，并打开排气阀。

4.排气：

打开电源加热灭菌锅，将水煮沸，使锅内的冷空气和水蒸汽一起从排气孔中排出。

一般认为当排出的气流很强并有嘘声时，表明锅内的空气已排尽，沸腾后约需5分钟。

5.升压：

冷空气完全排尽后，关闭排气阀，继续加热，锅内压力开始上升。

6.保压：

当压力表指针达到所需压力时，控制电源，开始计时并维持压力至所需的时间。

如本实验中采用0.1Mpa，121.5℃，20分钟灭菌。

灭菌的主要因素是温度而不是压力，因此锅内的冷空气必须完全排尽后，才能关闭排气阀，维持所需压力。

7.降压：

达到灭菌所需的时间后，切断电源，让灭菌锅温度自然下降，当压力表的压力降至“0”后，方可打开排气阀，排尽余下的蒸汽，旋松螺栓，打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。

压力一定要降到“0”后，才能打开排气阀，开盖取物。

否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基或试剂由于内外压力不平衡而冲出容器口，造成瓶口被污染，甚至灼伤操作者。

无菌检查：

将已灭菌的培养基放入37℃恒温培养箱培养24h，检查无杂菌生长后，即可。

革兰氏染色

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：

　　１）涂片固定。

在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，固定。

　　２）草酸铵结晶紫染1分钟。

　　３）自来水冲洗，去掉浮色。

　　４）用碘-碘化钾溶液媒染1分钟，倾去多余溶液。

　　５）用中性脱色剂如乙醇（95%）或丙酮酸脱色30秒，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。

６）用蕃红染液复染30秒，革兰氏阳性菌仍呈紫色，革兰氏阴性菌则呈现红色。

革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌即被区别开。

菌种的保存在含甘油和蒸馏水以1:

1的比例混合的冻存管里至于零下80摄氏度中。

冻存管规格为2mL，甘油和蒸馏水各0.5mL，菌液为1mL。

操作时注意事项：

在吸取菌液时，移液枪、冻存管管口和试管管口需在火焰周围防止杂菌混入，但不能离火焰太近避免菌种高温失活。

含甘油的冻存管需灭菌才能保存菌种。

药敏实验

1．制备培养基，一般以MH培养基为基础，依不同致病微生物，添加适宜成分。

2．菌液制备：

挑选鉴定后的致病菌微生物纯菌落，接种于MH液体培养基或营养肉汤培养基中，28.5摄氏度培养16-18个小时

3．平板上细菌的接种与贴药片：

用灭菌的棉签蘸取菌液少许，均匀涂于平板上，待干后（5分钟）左右，用灭菌的镊子分别取药敏片贴于培养基表面（每个平板上贴六个，外面贴成一个五角状，中间贴一个，距离平均），并用镊子轻按纸片中心，使其附着严密。

每次贴完一片，镊子要用酒精灯灭菌，然后用酒精棉擦拭凉却。

每个药敏片的简称要记录。

4．将贴好药敏片的培养皿倒置放入28.5摄氏度培养过夜培养。

5．用直尺量取抑菌圈的大小，取抑菌环最大直径（mm），每个药敏片直径为7mm。

6．根据纸片法药敏试验抑菌环直径判断标准，得出结果。

酒精棉的制备

用灭菌过的棉花浸泡在75％的酒精中，棉花大小在手掌握拳形成的缝隙大小。

分子实验操作部分

一、DNA的提取

1、酚仿抽提法

a、15ml的离心管加入600μl胞核裂解液，冰上冷却。

b、冷冻胞核裂解液中加入10-20mg新鲜或者解冻组织，小型匀浆机匀浆10秒。

将裂解产物转移到1.5ml微量离心管中。

﹙也可选择，使用研钵或研杵研磨预先冷冻在液氮中的组织。

研磨后，液氮挥发，转移大约10-20mg基本组织到含有600μl胞核裂解液的1.5ml微量离心管中。

﹚

c、65℃孵育裂解产物15-30分钟。

d、胞核裂解产物中加入3μl核糖核酸酶溶液颠倒离心管2-5次混合。

混合物37℃孵育15-30分钟。

下步之前样本冷却至室温5分钟。

e、冷却至室温的样本，加入200μl蛋白沉淀液，高速强力涡旋振荡20秒。

冰上冷却样本5分钟。

f、13000-16000xg离心4分钟。

沉淀的蛋白可形成一种致密的白色颗粒。

g、小心将含有DNA的上清转移至含有600μl室温异丙醇的1.5ml干净微量离心管。

﹙留下蛋白颗粒﹚

注意：

一些含有蛋白颗粒的上清可能仍留在原管中。

将这些残留液体留在原管中以免沉淀的蛋白污染DNA溶液。

h、轻柔颠倒混合溶液直到白色线状的DNA条带形成一种可见物。

i、13000-16000xg室温离心1分钟。

DNA可形成一种肉眼可见的白色小颗粒。

小心倾析出上清。

j、加入600μl室温70%的乙醇，轻柔颠倒离心管数次以洗脱DNA。

13000-16000xg室温离心1分钟。

k、用巴斯德吸管或测序移液管头小心抽吸乙醇。

此时DNA颗粒非常松散，注意避免把颗粒抽吸到吸管中。

l、将离心管倒转在干净的吸水纸上，风干颗粒10-15分钟。

m、加100μlDNA再水化液65℃孵育1小时再水化DNA。

周期性轻拍离心管混合溶液。

也可选择，室温或4μ℃过夜孵育再水化DNA。

n、DNA保存在4℃下。

2、水煮法提DNA

a、取1ml菌液至离心管，12000rpm离心1min，倒掉上清液，重复一次

b、在离心所得的细菌中加入10μL蒸馏水，100℃水浴10min

c、取出立即放入-80℃冰箱冻5min

d、拿出后放4℃让其融化，2-3min，在12000rpm离心10min

3、试剂盒提DNA

二、PCR操作：

（操作台照紫外灯20分钟后操作或在酒精灯旁操作）

1、反应体系：

模板2μL、dNTP2μL、10×

buffer1.6-2.4μL、氯化镁1.6-2.4μL、上游引物F0.1-0.5μL、下游引物R0.1-0.5μL、双蒸水15μL，TaqDNA酶0.2-0.5μL。

2、体系优化：

单因素梯度改变，其他因素不变。

例：

模板2μL、dNTP2μL、氯化镁1.6-2.4μL、上游引物F0.1-0.5μL、下游引物R0.1-0.5μL、双蒸水15μL，TaqDNA酶0.2-0.5μL，10×

buffer从1.6上升到2.4μL，每次增加0.4μL。

其他以此类推。

3、优化后体系：

（20μL）模板2μL、dNTP0.5μL、10×

buffer2μL、氯化镁1.6μL、上游引物F0.5μL、下游引物R0.5μL、双蒸水15μL，TaqDNA酶0.3μL。

4、操作过程：

将模板2μL、dNTP0.5μL、10×

buffer2μL、氯化镁1.6μL、上游引物F0.5μL、下游引物R0.5μL、双蒸水15μL，TaqDNA酶0.3μL逐一加到PCR反应管中，离心，使得试剂不粘附于管壁。

（当样多时，可将dNTP、10×

buffer、氯化镁、F、R、双蒸水、TaqDNA酶先加在一起，混匀，再依次加到PCR薄壁管中，18μL/管，先加对照组）

5、PCR反应过程：

模板DNA的预变性95℃，5min；

模板DNA的变性95℃，1min；

模板DNA和引物的退火54℃±

3℃（根据DNA链的长短决定），1min；

引物的延伸72℃，1.5min；

循环25次；

最后延伸72℃，10min；

4℃保存。

6、PCR结果出现非特异性条带原因：

a、引物聚合形成的二聚体或多聚体

b、Mg2+浓度过高

c、退火温度过低

d、PCR循环次数过多

e、酶的量过多

三、胶板的制备、电泳点样

1、Tris-乙酸（TAE）

使用液1×

：

0.04mol/LTris-乙酸0.001mol/LEDTA

储存液50×

242gTris碱，57.1ml冰乙酸，100ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）

电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。

2、胶板的制备

琼脂糖凝胶液：

琼脂糖/1×

TAE为0.012g/ml，然后放入微波炉加热，沸腾3—4次，至全部溶解，并且没有气泡；

大胶板40ml，小胶板20ml。

琼脂糖凝胶液冷却至50—60℃，加入goldview（1μL/ml），摇匀，不可产生气泡；

制胶槽固定位置插上梳子，将混匀后的凝胶液小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×

TAE电泳缓冲液至没过胶板1-2mm为止。

3、电泳点样（发表文章使用点样5μL；

切胶回收点样4μL；

判断下RCR有无产物点样2μL）

取出PCR产物，每5μLPCR产物加入缓冲液loadingbufferμL，充分混匀，用10μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面（注意:

加样前要先记下加样的顺序）。

最后加入DNAMarker（点样的时候靠边的点样孔最好不要点样）。

电压100V，进行电泳40min。

四、拍照、图片处理

1、琼脂糖凝胶电泳结束后，将胶板从电泳槽中取出，放入凝胶成像系统，拍照

2、利用photoshop软件进行图片处理。

五、切胶纯化、测序

1、切胶纯化

a、在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，计算凝胶重量。

（100mg凝胶，计100ul体积）（尽量缩短暴露UV灯下的时间！

）

b、加入3个凝胶体积的BufferDE-A（600uL），混合均匀后，于65°

C加热，直至凝胶完全熔化。

c、加0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B（300uL）,混合均匀，当分离的DNA片段小于400bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇。

d、吸取3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2ml离心管中），12，000×

g离心1min。

弃滤液。

e、将制备管置回2ml离心管中，加500uLBufferW1，12，000×

g离心30sec，弃滤液。

f、将制备管置回2ml离心管中，加700uLBufferW2,12，000×

重复一次。

g、将制备管置回2ml离心管中，12，000×

彻底去除残余的液体。

h、将制备管置于1.5ml离心管中，在制备膜中央，加25～30ul65°

CEluent或去离子水，室温静置1min。

12，000×

g离心1min洗脱DNA。

2、送测

六、序列比对

1、序列下载

a、进入BCBI界面，点“blast”

点blastn

b、选择others，在方框内输入序列

c、display中选择“Fasta”

d、

e、将方框内的基因序列复制黏贴到文本文档

f、以此法下载30个序列

2、序列提交

a、搜索获得细菌的16srRNA序列复制

b、进入BankIt页面点击New按钮准备提交序列

c、填写相关信息

d、输入该序列并点击保存

e、下载并运行Sequin

f、将核酸序列输入框中

g、添加Organism

h、编辑

i、检查错误

j、修改

k、保存

3、基因比对，构建发育树

a、打开ClustalX

b、

c、

e、进行完全比对

f、

g、

h、由于后面无法用aln格式转化的meg格式打开，所以此改用fasta格式保存并命名为cob2

i、

j、选择此项可打开比对过的文件

k、

l、

m、

n、

o、

p、

q、选择邻接法（NJ法）构建系统发育树

r、设置Bootstrap值为100，设置Gap处理为两两删除，设置模型为Kimura-2-Parameter

s、得原始的树

t、保存