加速衰老小鼠脑组织中的衰老相关基因的表达Word文档下载推荐.docx
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1.InstituteofGeneticsandDevelopmentalBiology,TheChineseAcademyofSciences,Beijing100080,China
2.GraduateSchoolofChineseAcademyofSciences,Beijing100039,China
3.LingtaiBichenMedicalTechnologyCo.Ltd.Beijing,100086,China
AbastractAbetterunderstandingofthemoleculareffectsofageinginthebrainmayhelptorevealimportantaspectsoforganismalageing,aswellasprocessesthatleadtoageing-relatedbraindysfunction.Inthisstudy,theageing-specificexpressiongenesofthemurinecerebrumwereinvestigatedbyemployingdifferential-displayreversetranscriptionpolymerasechainreaction（DDRT-PCR）inthreesenescence-acceleratedmouse（SAM）strains:
SAMP8/Ta,SAMP10/TaandSAMR1TA.Throughcomparedgeneexpressionprofileamongtheage18,12,4,and2monthoftheSAMP10/Tastrain,twodifferentialfragmentshavebeenfound,whichbelongto4and12monthindividually;
andinage11,4and2monthoftheSAMP8/Tastrain,twofragmentshavebeenfound,whichbelongto11and2monthrespectively.Andcomparedgeneexpressionprofileindifferentstrainsmice,16fragmentshavebeendetected,3,6and7ofthembelongtoSAMP10/Ta,SAMP8/TaandSAMR1TArespectively.Sequenceresultsindicatethatthosefragmentsarehomologouswithheatshockproteincognateprotein70，ATP-dependentmitochondrialRNAhelicase,Dleu2mRNA,MouseDNAsequencefromcloneRP23-334C3onchromosomeX,ubiquinol-cytochromecreductasecomplex（7.2kD）,60SribosomalproteinL21,FIS,phenylalkylamineCa2+antagonist（emopamil）bindingprotein,fucosyltransferase9,glialcelllinederivedneurotrophicfactorfamilyreceptoralpha1,endonuclease/reversetranscriptase,PER1interactingproteinofthesuprachiamaticnucleushomolog,centrosomalproteinCG-NAP,ferritinheavychaingene,NID-2gene,andprkdcgeneforDNA-dependentproteinkinasecatalyticsubunit[ActaZoologicaSinica50（4）:
-,2004].
KeywordsSenescence-AcceleratedMouse,Ageing-associatedgeneexpression,Differentialdisplayreversetranscriptionpolymerasechainreaction;
CerebralTissue
衰老是指机体达到其最大繁殖能力后生理功能的进行性降低（Royetal.,1996）,是一个自发而又与早期的程序化发育相对应的过程。
机体的寿命取决于许多因素，其中包括遗传因素（Finchetal.,1997;
Pucaetal.,2001）、激素和生长因子信号（Flurkeyetal.,2001;
Coschiganoetal.,2000）、体重（Piantanellietal.,2001）、体脂含量和环境因素（Coschiganoetal.,2000;
Masoro,2000）等。
进化理论认为衰老并非是机体的适应性特征，而是随着时间推移机体许多功能注定丧失的结果。
医疗记录也给我们这样的印象：
衰老是许多独立导致疾病并最终导致死亡的退行性变化过程的集合（Hekimietal.,2003）。
模式动物加速衰老小鼠（Senescence-AcceleratedMouse，SAM）是由一系列相关的纯系所组成，包括9个短寿的加速衰老品系和3个寿命较长的正常衰老的品系（Takedaetal.,1981，1991）。
SAMP系小鼠显示系特异性衰老相关的病理表型，包括出现衰老表征提前和寿命缩短。
本研究应用了三个品系小鼠作为研究对象，以期发现衰老相关表达的基因。
其中，SAMP8/Ta与SAMP10/Ta表现为短寿及与鼠龄相关的学习认知损害、情感紊乱、昼夜节律异常，SAMP8/Ta还表现免疫损害；
SAMR1TA则为正常寿命且无衰老相关病理表型的对照系（Takeda，1999）。
SAM模式小鼠显示出的加速衰老的病理表型说明：
衰老至少从一定意义上来说是受遗传控制的。
迄今为止，SAM小鼠己被广泛用于衰老相关性疾病的研究，但很少涉及导致其寿命缩短的分子机理的研究（Zhangetal.,2002;
Kumaretal.,2000）。
因此，我们应用DDRT-PCR方法对不同鼠龄和不同品系的加速衰老小鼠（SAM）脑组织进行了比较研究，以期找出与衰老相关的基因片段，进而为进一步研究衰老的分子机制打下基础。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1实验动物及饲养条件SAMR1TA、SAMP8/Ta、SAMP10/Ta系小鼠购自日本京都大学，在本所实验动物中心按普通级进行饲养，12小时明暗光周期，自由饮水及采食。
实验中动物使用饲料为购自军事医学科学院实验动物中心饲料厂的商业化小鼠饲料。
1.1.2实验用试剂RNA小量提取试剂盒（Qiagen）、QIAshredderTM（Qiagen）、PCR管（Axygen）、M-MuLV逆转录酶（Biolabs?
Inc.）、dNTP（promga）、TaqDNA聚合酶（Promga）、α-32p-dCTP（亚辉）、无RNA酶的DNA酶（Promga）、RNA酶抑制剂（Promga）、尿素（Promga）、糖原（Sigma）、琼脂糖（Biowest）、Wizard?
PCRPrepsDNA纯化系统（Promga）、pGEM?
-TEasy载体（Promga）、氨苄青霉素（sigma）、IPTG（Promga）、X-Gal（Promga）、DH5α感受态菌（天威时代）、UltraPureTM质粒纯化试剂盒（赛百盛）、X光胶片（FujiPhotoFilmCo.Ltd.）、BDMarathonTMcDNA扩增试剂盒（BDBioscienceClontech）、PROTRAN?
硝酸纤维素转印膜（Schleicher&
Schuell）、预杂交及杂交液（上海生物工程技术服务有限公司）、随机引物DNA标记试剂盒（TaKaRaBiotechnologyCo.Ltd.）。
1.1.3实验用引物:
由赛百盛公司合成，序列如下：
A1:
5’-ACAGAGCACA；
APG:
5’-AAGCTTTTTTTTTTTTG；
APC:
5’-AAGCTTTTTTTTTTTTC；
APA:
5’-AAGCTTTTTTTTTTTTA。
1.2方法
1.2.1总RNA提取实验用雄性小鼠断颈处死，撕去头部皮肤，打开头盖骨，取出脑组织。
切取大脑左前部1/2约30mg,放入玻璃研磨器中，加入裂解液后研磨，按RNeasyminiKit操作方法提取总RNA。
经无RNA酶的DNA酶处理后备用。
1.2.2RNA逆转录在PCR管中加入2μl总RNA（约1μg）、10XRTbuffer4μl、2.5mMdNTP1.6μl、3’引物2μl、RNA酶抑制剂（40iu/μl）0.5μl、加水至19μl。
65℃5min，42℃10min、加入M-MuLV逆转录酶1μl（200iu）,37℃50min、75℃5min。
1.2.3逆转录产物的PCR扩增反应体系为逆转录产物2μl、10XBuffer2μl、25mMMgCl22μl、2.5mMdNTP1.6μl、5’引物（2μM）2μl、3’引物（2μM）2μl、TaqDNA聚合酶（5iu/μl）0.4μl、α-32P-dCTP（10μCi/μl）0.5μl、加水至20μl。
PCR反应参数为94℃10min；
94℃1min,40℃2min，72℃1min，40个循环；
72℃5min。
1.2.4℃曝光72小时后显影，找出差异性条带。
从凝胶上切取差异条带，加入100μl双蒸水，室温浸泡10min，煮沸15min。
离心取上清，加入3M乙酸钠（PH5.2）10μl，糖原（20mg/ml）2.5μl,无水乙醇450μl，－20℃过夜。
4℃离心10min，沉淀用冰预冷的85%乙醇洗涤后溶于10μl双蒸水中。
再扩增反应体系为回收产物4μl、10×
Buffer4μl、25mMMgCl24μl、2.5mMdNTP3.2μl、5’引物（2μM）4μl、3’引物（2μM）4μl、TaqDNA聚合酶（5iu/μl）0.8μl、加水至40μl。
PCR反应参数为94℃10min；
94℃1min,40℃2min，72℃1min，20个循环；
72℃5min；
94℃10min；
72℃5min。
1.2.5再扩增产物的鉴定及纯化取部分再扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，其余部分用Wizard?
PCRPrepsDNA纯化系统进行纯化。
1.2.6纯化产物的连接及转化将纯化产物连入pGEM?
-TEasy载体。
转化感受态DH5α大肠杆菌。
加SOC培养基37℃，150转/min，培养1.5小时。
LB/amp/IPTG/X-Gal平板涂布，37℃培养16小时。
挑取单个白色菌落，接种LB/amp培养基37℃,150转/min培养过夜。
1.2.7质粒提取及鉴定取单菌落过夜培养物按UltraPureTM质粒DNA小量提取试剂盒使用说明提取质粒DNA。
进行PCR扩增，1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
PCR反应体系为提取质粒2μl、10XBuffer2μl、25mMMgCl22μl、2.5mMdNTP1.6μl、5’引物（2μM）2μl、3’引物（2μM）2μl、TaqDNA聚合酶（5iu/μl）0.4μl、加水至20μl。
94℃1min,40℃2min，72℃1min，30个循环；
1.2.8测序及GenBank检索分析测序交由上海生工和上海博亚进行。
测序结果通过GenBank检索进行同源性比较分析。
1.2.9差异表达片段的VirtualNorthernBlot验证总RNA按BDMarathonTMcDNA扩增试剂盒使用说明进行逆转录并扩增后电泳。
按Sambrook和Russell（2001）介绍的方法经转膜后进行杂交。
2结果
使用DDRT-PCR方法，我们比较了同品系不同鼠龄SAM小鼠（SAMP8/Ta鼠龄分别为2,3.5,11个月；
SAMP10/Ta鼠龄分别为2,4,12,18.5个月；
SAMR1TA鼠龄分别为2,4,12,18个月）脑组织的基因表达情况，找到了4个差异表达片段，分别属于4月龄与12月龄的SAMP10/Ta和2月龄与11月龄的SAMP8/Ta。
对不同品系SAM小鼠脑组织的基因表达情况比较共发现了42个差异性条带。
图1,2显示部分DDRT-PCR结果。
图1.不同鼠龄SAMP10/Ta脑组织DDRT-PCR结果
Fig1.ResultsoftheDDRT-PCRforthecerebaltissuesofdifferentageSAMP10/Ta
箭头所示为差异性表达条带。
图下数字表示如下：
1、2为2月龄SAMP10/Ta，3、4为4月龄SAMP10/Ta，5、6为12月龄SAMP10/Ta，7、8为18月龄SAMP10/Ta。
Thearrowheadshowsthedifferentialdisplaybands.Thenumbersbelowthefigurepresentasfollows:
1and2samplesfrom2monthSAMP10/Ta,3and4samplesfrom4monthSAMP10/Ta,5and6samplesfrom12monthSAMP10/Ta,and7and8Samplesfrom18monthSAMP10/Ta.
图2不同品系SAM小鼠脑组织DDRT-PCR结果
Fig.2ResultsoftheDDRT-PCRforcerebaltissueofdifferentSAMstrains
图下数字表示：
1、2为2月龄SAMP8/Ta，3、4为4月龄SAMP8/Ta，5、6为11月龄SAMP8/Ta，7、8为2月龄SAMR1TA，9、10为4月龄SAMR1TA，11、12为11.5月龄SAMR1TA，13、14为18月龄SAMR1TA。
Thearrowheadshowsthedifferentialdisplaybands.Thenumbersbelowthefigurepresentthesamplesfromasfollows:
1and2SAMP8/Taof2month,3and4SAMP8/Taof4month,5and6SAMP8/Taof11month,7and8SAMR1TAof2month,9and10SAMR1TAof4month,11and12SAMR1TAof11.5month,and13and14SAMR1TAof18month.
在所获得的这些条带中，20个己成功再扩增，并经连接转化后进行了测序分析。
经NCBI-BLAST同源性检索，其结果见表1。
表1差异表达片段NCBI-BLAST检索结果
Table1FeaturesofSequencedCloneandResultsofBLASTSearch
序号大小（bp）*同源序列（BLAST）登陆号同源性比较大小
No.Size（bp）Sequencehomology（BLAST）AccessionNo.identity/%Overlap
1**120bp小家鼠（Musmusculus）热休克识别蛋白70mRNABC006722.199%104
Musmusculusheatshockcognateprotein70mRNA
2132bp小家鼠（Musmusculus）mRNA，类似于酿洒酵母BC04979694%142
（S.cerevisiae）的var1,3抑制蛋白-1
Musmusculus，similartosuppressorofvar1,3-like1
（S.cerevisiae）mRNA
3166bp小家鼠（Musmusculus）X染色体克隆RP23-334C3DNAAL672057.8100%132
MusmusculusDNAsequencefromcloneRP23-334C3on
chromosomeX
4181bp小家鼠（Musmusculus）Dleu2mRNAAF38042398%191
MusmusculusDleu2mRNA
7256bp小家鼠（Musmusculus）还原型辅酶Q-细胞色素c还原酶BC024518.199%263
复合物7.2kD亚单位mRNA
MusmusculusmRNA,Similartoubiquinol-cytochromec
reductasecomplex（7.2kD）
12227bp小家鼠（Musmusculus）60S核糖体蛋白L21mRNAXM_193408.199%235
MusmusculusmRNA,similarto60SribosomalproteinL21
13198bp小家鼠（Musmusculus）FIScDNAAK003875.1100%206
MusmusculussimilartoFIScDNA
14198bp小家鼠（Musmusculus）FIScDNAAK003875.1100%206
16135bp小家鼠（Musmusculus）苯基烷胺拮抗物（emopamil）Ca2+BC004703.1100%143
离子结合蛋白mRNA
Musmusculusphenylalkyl-amineCa2+antagonist
（emopamil）bindingproteinmRNA
19132bp小家鼠（Musmusculus）岩藻糖基转移酶cDNAAK047650.194%136
Musmusculusfucosyl-transferase9cDNA
20103bp小家鼠（Musmusculus）胶质细胞源性神经营养因子mRNABC040251.1100%73
Musmusculus,Similartoglialcelllinederived
neurotrophicfactorfamilyreceptoralpha1mRNA
24255bp小家鼠（Musmusculus）还原型辅酶Q-细胞色素c还原酶BC024518.199%263
MusmusculusmRNA,Similartoubiquinol-cytochromec
reductasecomplex（7.2kD）
25112bp小家鼠（Musmusculus）核酸内切酶/逆转录酶mRNAXM_207118.294%121
MusmusculusmRNA,similartoendonucle-ase/reverse
transcriptase
27111bp小家鼠（Musmusculus）cDNA,产物与大家鼠（RattusAK050919.197%122
norvegicus）上视交叉核的PER1相互作用蛋白同源
Musmusculus,PER1interactingproteinofthe
suprachiamaticnucleushomolog[Rattusnorvegicus]
29108bp大家鼠（Rattusnorvegi
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