加速衰老小鼠脑组织中的衰老相关基因的表达Word文档下载推荐.docx

1、1. Institute of Genetics and Developmental Biology, The Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080, China2. Graduate School of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China3. Lingtai Bichen Medical Technology Co. Ltd. Beijing, 100086, ChinaAbastract A better understanding of the molecular effe

2、cts of ageing in the brain may help to reveal important aspects of organismal ageing, as well as processes that lead to ageing-related brain dysfunction. In this study, the ageing-specific expression genes of the murine cerebrum were investigated by employing differential-display reverse transcripti

3、on polymerase chain reaction （DDRT-PCR） in three senescence-accelerated mouse （SAM） strains: SAMP8/Ta, SAMP10/Ta and SAMR1TA. Through compared gene expression profile among the age 18, 12, 4, and 2 month of the SAMP10/Ta strain, two differential fragments have been found, which belong to 4 and 12 mo

4、nth individually; and in age 11, 4 and 2 month of the SAMP8/Ta strain, two fragments have been found, which belong to 11 and 2 month respectively. And compared gene expression profile in different strains mice, 16 fragments have been detected, 3, 6 and 7 of them belong to SAMP10/Ta, SAMP8/Ta and SAM

5、R1TA respectively. Sequence results indicate that those fragments are homologous with heat shock protein cognate protein 70，ATP-dependent mitochondrial RNA helicase, Dleu2 mRNA, Mouse DNA sequence from clone RP23-334C3 on chromosome X, ubiquinol-cytochrome c reductase complex （7.2 kD）, 60S ribosomal

6、 protein L21, FIS, phenylalkylamine Ca2+ antagonist （emopamil） binding protein, fucosyltransferase 9, glial cell line derived neurotrophic factor family receptor alpha 1, endonuclease/reverse transcriptase, PER1 interacting protein of the suprachiamatic nucleus homolog, centrosomal protein CG-NAP, f

7、erritin heavy chain gene, NID-2 gene, and prkdc gene for DNA-dependent protein kinase catalytic subunit Acta Zoologica Sinica 50（4）: - , 2004. Key words Senescence-Accelerated Mouse, Ageing-associated gene expression, Differential display reverse transcription polymerase chain reaction; Cerebral Tis

8、sue衰老是指机体达到其最大繁殖能力后生理功能的进行性降低（Roy et al., 1996）,是一个自发而又与早期的程序化发育相对应的过程。机体的寿命取决于许多因素，其中包括遗传因素（Finch et al.,1997; Puca et al., 2001）、激素和生长因子信号（Flurkey et al., 2001;Coschigano et al., 2000）、体重（Piantanelli et al., 2001）、体脂含量和环境因素（Coschigano et al., 2000; Masoro, 2000）等。进化理论认为衰老并非是机体的适应性特征，而是随着时间推移机体许多功能

9、注定丧失的结果。医疗记录也给我们这样的印象：衰老是许多独立导致疾病并最终导致死亡的退行性变化过程的集合（Hekimi et al., 2003）。模式动物加速衰老小鼠（Senescence-Accelerated Mouse，SAM）是由一系列相关的纯系所组成，包括9个短寿的加速衰老品系和3个寿命较长的正常衰老的品系（Takeda et al.,1981，1991）。SAMP系小鼠显示系特异性衰老相关的病理表型，包括出现衰老表征提前和寿命缩短。本研究应用了三个品系小鼠作为研究对象，以期发现衰老相关表达的基因。其中，SAMP8/Ta与SAMP10/Ta表现为短寿及与鼠龄相关的学习认知损害、情感紊

10、乱、昼夜节律异常，SAMP8/Ta还表现免疫损害；SAMR1TA则为正常寿命且无衰老相关病理表型的对照系（Takeda，1999）。SAM模式小鼠显示出的加速衰老的病理表型说明：衰老至少从一定意义上来说是受遗传控制的。迄今为止，SAM小鼠己被广泛用于衰老相关性疾病的研究，但很少涉及导致其寿命缩短的分子机理的研究（Zhang et al., 2002; Kumar et al., 2000）。因此，我们应用DDRT-PCR方法对不同鼠龄和不同品系的加速衰老小鼠（SAM）脑组织进行了比较研究，以期找出与衰老相关的基因片段，进而为进一步研究衰老的分子机制打下基础。1 材料和方法1.1 材料1.1.1

11、 实验动物及饲养条件 SAMR1TA、SAMP8/Ta、SAMP10/Ta系小鼠购自日本京都大学，在本所实验动物中心按普通级进行饲养，12小时明暗光周期，自由饮水及采食。实验中动物使用饲料为购自军事医学科学院实验动物中心饲料厂的商业化小鼠饲料。1.1.2 实验用试剂 RNA小量提取试剂盒（Qiagen）、 QIAshredderTM （Qiagen）、 PCR 管（Axygen）、M-MuLV逆转录酶（Biolabs?Inc.）、dNTP （promga）、Taq DNA聚合酶 （Promga）、-32p-dCTP（亚辉）、无RNA酶的DNA酶（Promga）、RNA酶抑制剂（Promga）、

12、尿素（Promga）、糖原（Sigma）、琼脂糖（Biowest）、Wizard? PCR Preps DNA纯化系统（Promga）、pGEM?-T Easy载体（Promga）、氨苄青霉素（sigma）、IPTG（Promga）、X-Gal （Promga）、 DH5感受态菌（天威时代）、UltraPureTM 质粒纯化试剂盒（赛百盛）、X光胶片（Fuji Photo Film Co.Ltd.）、BD MarathonTM cDNA 扩增试剂盒（BD Bioscience Clontech）、 PROTRAN? 硝酸纤维素转印膜（Schleicher&Schuell）、 预杂交及杂交液（上

13、海生物工程技术服务有限公司）、 随机引物DNA标记试剂盒（TaKaRa Biotechnology Co.Ltd.）。 1.1.3 实验用引物:由赛百盛公司合成，序列如下：A1: 5-ACAGA GCACA； APG: 5-AAGCT TTTTT TTTTT TG；APC: 5-AAGCT TTTTT TTTTT TC；APA: 5-AAGCT TTTTT TTTTT TA。1.2 方法1.2.1 总RNA提取 实验用雄性小鼠断颈处死，撕去头部皮肤，打开头盖骨，取出脑组织。切取大脑左前部1/2约30mg,放入玻璃研磨器中，加入裂解液后研磨，按RNeasy mini Kit操作方法提取总RNA。

14、经无RNA酶的DNA酶处理后备用。1.2.2 RNA逆转录 在PCR管中加入2l总RNA（约1g）、10X RT buffer 4l、2.5mM dNTP 1.6l、3引物 2l、RNA酶抑制剂（40iu/l） 0.5l、加水至19l。65 5 min，4210 min、加入M-MuLV 逆转录酶1l （200iu）,37 50 min、75 5 min。1.2.3 逆转录产物的PCR扩增 反应体系为逆转录产物2l、10X Buffer 2l、25mM MgCl2 2l 、2.5mM dNTP 1.6l、5引物（2M）2l、3引物（2M） 2l、Taq DNA聚合酶（5iu/l） 0.4l、-

15、32P-dCTP （10Ci/l） 0.5l、加水至20l。PCR反应参数为9410 min；941 min,402 min，721 min，40个循环；725 min。1.2.4曝光72小时后显影，找出差异性条带。从凝胶上切取差异条带，加入100l双蒸水，室温浸泡10 min，煮沸15 min。离心取上清，加入3M乙酸钠（PH5.2）10l，糖原（20mg/ml）2.5l, 无水乙醇450l，20过夜。4离心10 min，沉淀用冰预冷的85%乙醇洗涤后溶于10l双蒸水中。再扩增反应体系为回收产物4l、10 Buffer 4l、25mM MgCl2 4l 、2.5mM dNTP 3.2l、5引

16、物（2M）4l、3引物（2M） 4l、Taq DNA聚合酶（5iu/l） 0.8l、加水至40l。PCR反应参数为94 10 min；94 1 min,40 2 min，72 1 min，20个循环；72 5 min；94 10 min；72 5 min。1.2.5 再扩增产物的鉴定及纯化 取部分再扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，其余部分用Wizard? PCR Preps DNA 纯化系统进行纯化。1.2.6 纯化产物的连接及转化 将纯化产物连入pGEM?-T Easy 载体。转化感受态DH5大肠杆菌。加SOC培养基37，150转/ min，培养1.5小时。LB/amp/IPTG/X-

17、Gal平板涂布，37培养16小时。挑取单个白色菌落，接种LB/amp培养基37,150转/ min培养过夜。1.2.7 质粒提取及鉴定 取单菌落过夜培养物按UltraPureTM质粒DNA小量提取试剂盒使用说明提取质粒DNA。进行PCR扩增，1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。PCR反应体系为提取质粒2l、10X Buffer 2l、25mM MgCl2 2l 、2.5mM dNTP 1.6l、5引物（2M）2l、3引物（2M） 2l、Taq DNA聚合酶（5iu/l） 0.4l、加水至20l。941 min,402 min，721 min，30个循环；1.2.8 测序及GenBank检索分析 测序交

18、由上海生工和上海博亚进行。测序结果通过GenBank检索进行同源性比较分析。1.2.9 差异表达片段的Virtual Northern Blot验证 总RNA按BD MarathonTM cDNA 扩增试剂盒使用说明进行逆转录并扩增后电泳。按Sambrook和Russell（2001）介绍的方法经转膜后进行杂交。2 结 果使用DDRT-PCR方法，我们比较了同品系不同鼠龄SAM小鼠（SAMP8/Ta 鼠龄分别为 2, 3.5, 11个月； SAMP10/Ta鼠龄分别为2, 4, 12, 18.5个月；SAMR1TA鼠龄分别为2, 4, 12, 18个月）脑组织的基因表达情况，找到了4个差异表达

19、片段，分别属于4月龄与12月龄的SAMP10/Ta 和2月龄与11月龄的SAMP8/Ta。对不同品系SAM小鼠脑组织的基因表达情况比较共发现了42个差异性条带。图1,2显示部分DDRT-PCR结果。图1.不同鼠龄SAMP10/Ta脑组织DDRT-PCR结果Fig 1. Results of the DDRT-PCR for the cerebal tissues of different age SAMP10/Ta 箭头所示为差异性表达条带。图下数字表示如下：1、2为2月龄SAMP10/Ta，3、4为4月龄SAMP10/Ta，5、6为12月龄 SAMP10/Ta，7、8为18月龄 SAMP10

20、/Ta。The arrowhead shows the differential display bands. The numbers below the figure present as follows: 1 and 2 samples from 2 month SAMP10/Ta, 3 and 4 samples from 4 month SAMP10/Ta, 5 and 6 samples from 12 month SAMP10/Ta, and 7and 8 Samples from 18 month SAMP10/Ta.图2 不同品系SAM小鼠脑组织DDRT-PCR结果Fig. 2

21、 Results of the DDRT-PCR for cerebal tissue of different SAM strains图下数字表示：1、2为2月龄SAMP8/Ta，3、4为4月龄SAMP8/Ta，5、6为11月龄SAMP8/Ta，7、8为2月龄SAMR1TA，9、10为4月龄 SAMR1TA，11、12为11.5月龄SAMR1TA，13、14为18月龄SAMR1TA。The arrowhead shows the differential display bands. The numbers below the figure present the samples from

22、as follows: 1 and 2 SAMP8/Ta of 2 month, 3 and 4 SAMP8/Ta of 4 month, 5 and 6 SAMP8/Ta of 11 month, 7 and 8 SAMR1TA of 2 month, 9 and 10 SAMR1TA of 4 month, 11 and 12 SAMR1TA of 11.5 month, and 13 and 14 SAMR1TA of 18 month.在所获得的这些条带中，20个己成功再扩增，并经连接转化后进行了测序分析。经NCBI-BLAST同源性检索，其结果见表1。表1 差异表达片段NCBI-BL

23、AST检索结果Table 1 Features of Sequenced Clone and Results of BLAST Search序号 大小（bp）* 同源序列（BLAST） 登陆号 同源性 比较大小No. Size （bp） Sequence homology（BLAST） Accession No. identity/% Overlap1* 120 bp 小家鼠（Mus musculus）热休克识别蛋白70 mRNA BC006722.1 99% 104Mus musculus heat shock cognate protein 70 mRNA2 132 bp 小家鼠（Mus

24、musculus） mRNA，类似于酿洒酵母 BC049796 94% 142（S.cerevisiae）的var1, 3抑制蛋白-1 Mus musculus，similar to suppressor of var1, 3-like 1（S.cerevisiae） mRNA3 166 bp 小家鼠（Mus musculus） X染色体克隆RP23-334C3 DNA AL672057.8 100% 132 Mus musculus DNA sequence from clone RP23-334C3 onchromosome X4 181 bp 小家鼠（Mus musculus） Dleu

25、2 mRNA AF380423 98% 191 Mus musculus Dleu2 mRNA7 256 bp 小家鼠（Mus musculus） 还原型辅酶Q-细胞色素c 还原酶 BC024518.1 99% 263复合物7.2kD亚单位mRNA Mus musculus mRNA, Similar to ubiquinol-cytochrome c reductase complex （7.2 kD）12 227 bp 小家鼠（Mus musculus） 60S核糖体蛋白L21mRNA XM_193408.1 99% 235 Mus musculus mRNA, similar to 60

26、S ribosomal protein L21 13 198 bp 小家鼠（Mus musculus） FIS cDNA AK003875.1 100% 206 Mus musculus similar to FIS cDNA 14 198 bp 小家鼠（Mus musculus） FIS cDNA AK003875.1 100% 20616 135 bp 小家鼠（Mus musculus）苯基烷胺拮抗物（emopamil） Ca2+ BC004703.1 100% 143离子结合蛋白mRNA Mus musculus phenylalkyl-amine Ca2+ antagonist （em

27、opamil） binding protein mRNA 19 132 bp 小家鼠（Mus musculus）岩藻糖基转移酶cDNA AK047650.1 94% 136Mus musculus fucosyl-transferase 9 cDNA20 103 bp 小家鼠（Mus musculus）胶质细胞源性神经营养因子mRNA BC040251.1 100% 73 Mus musculus, Similar to glial cell line derivedneurotrophic factor familyreceptor alpha 1 mRNA24 255 bp 小家鼠（Mus

28、 musculus） 还原型辅酶Q-细胞色素c还原酶 BC024518.1 99% 263Mus musculus mRNA, Similar to ubiquinol-cytochrome creductase complex （7.2 kD）25 112 bp 小家鼠（Mus musculus）核酸内切酶/逆转录酶mRNA XM_207118.2 94% 121Mus musculus mRNA, similar to endonucle- ase/reverse transcriptase27 111 bp 小家鼠（Mus musculus） cDNA,产物与大家鼠（Rattus AK050919.1 97% 122norvegicus）上视交叉核的PER1相互作用蛋白同源 Mus musculus, PER1 interacting protein of thesuprachiamatic nucleus homolog Rattus norvegicus29 108 bp 大家鼠（Rattus norvegi