猪支原体肺炎疫苗多菌株免疫效果比较分析Word格式.docx
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A.猪支原体肺炎活疫苗AN306株F321,由江苏省农业科学院兽医所研制,规格为2×
107CCU/瓶(2ml冻干),批号为20140325。
有效期:
______。
PCR鉴定:
Mhp_____,Mhr_______。
B.猪支原体肺炎活疫苗(168株),由南京天邦生物科技有限公司提供,规格为50头份/瓶,批号为139078-1。
C.猪支原体肺炎活疫苗(乳兔继代株),由吉林正业生物科技有限公司提供,规格为4头份/瓶,批号为2014002。
_20150110__
D.猪支原体肺炎灭活疫苗(P-5722-3株,SuvaxynRespiFendMH),由上海硕腾(辉瑞)提供,规格为50头份/瓶,批号为1302777A。
15/11/16_
2.1.1.2试剂
A.猪支原体肺炎活疫苗(乳兔继代株)稀释液,批号:
2014002;
20170115
B.猪支原体肺炎雾化活疫苗稀释液
C.猪支原体肺炎肌注活疫苗佐剂G-1-1
2.1.2动物
选择猪肺炎支原体抗体、抗原均阴性的5-10日龄仔猪,54头.
饲养地点:
饲养员:
_徐飞扬,陈才__
仔猪免疫状况:
未打气喘病疫苗。
2.1.3动物饲料
仔猪料:
2.1.4设备
气雾免疫设备、滴鼻头、20(10、5、2)ml注射器、耳标、耳号钳、冰盒、相机、解剖器械、离心管。
2.1.5攻毒用强毒
猪肺炎支原体强毒JS株组织强毒,来自本所,批号20130625,-20℃保存,有效期至:
2014/06/25。
2.2方法
2.2.1动物分组说明
G1:
-猪支原体肺炎活疫苗168株肺内免疫组。
每头猪肺内注射免疫1头份(1ml)即1×
107CCU的猪支原体肺炎活疫苗168株。
免疫一次,一免后6周攻毒,攻毒后28天剖杀。
G2:
-猪支原体肺炎活疫苗AN306株肺内免疫组。
每头猪肺内注射免疫1ml,即1×
107CCU的猪支原体肺炎活疫苗AN306株。
免疫一次,6周后攻毒,攻毒后28天剖杀。
G3:
-猪支原体肺炎活疫苗168株气雾免疫组。
每头猪气雾免疫5×
107CCU的猪支原体肺炎活疫苗168株。
G4:
-猪支原体肺炎活疫苗168株肌注免疫组。
每头猪肌肉注射免疫5×
首免后两周二免,一免后6周攻毒,攻毒后28天剖杀。
G5:
-猪支原体肺炎灭活疫苗肌注免疫组。
每头猪肌肉注射免疫1头份(2ml)猪支原体肺炎灭活疫苗。
首后2周,加强免疫一次,首免后6周攻毒,攻毒后28天剖杀。
G6:
-猪支原体肺炎乳兔活疫苗胸腔免疫组。
每头猪胸腔注射免疫1头份(5ml)猪支原体肺炎乳兔活疫苗。
G7:
-猪支原体肺炎乳兔活疫苗滴鼻免疫组。
每头猪滴鼻免疫?
头份猪支原体肺炎乳兔活疫苗。
G8:
-健康对照组(不免疫,不攻毒)。
不接种疫苗。
不攻毒,其它组攻毒后28天剖杀。
G9:
攻毒对照组(不免疫,只攻毒)。
不免疫疫苗,只攻毒,攻毒后28天剖杀。
2.2.2动物分组与试验操作概表
组号
组别
N
疫苗
剂量
DPI-0
DPI-7
DPI-14
DPI-21
DPI-28
DPI-35
DPI-42
DPI-70
G1
168肺内组
6
天邦
1×
107CCU/头(1头份)
肺内免疫/采血/鼻拭子/称重
鼻拭子
采血/鼻拭子
采血/鼻拭子/攻毒/称重
剖检/称重
G2
AN306肺内组
ADC
107CCU/头
G3
168气雾组
5×
气雾免疫/采血/鼻拭子/称重
G4
168肌注组
肌注免疫/采血/鼻拭子/称重
肌注免疫/鼻拭子
G5
灭活苗组
辉瑞
2ml/1头份
G6
乳兔苗胸腔组
吉林正业
5ml/1头份
胸腔免疫/采血/鼻拭子/称重
采血/采血/鼻拭子
G7
乳兔苗滴鼻组
1头份
滴鼻免疫/采血/鼻拭子/称重
G8
健康对照组
-
采血/鼻拭子/称重
G9
攻毒对照组
称重
攻毒/称重
总计
54
2.2.3免疫
G1—猪支原体肺炎活疫苗168株肺内免疫组
用灭菌生理盐水50ml溶解168活疫苗冻干粉1瓶,使活疫苗终浓度为1×
107CCU/ml,1头份/ml。
每头猪肺内免疫1ml,即1×
107CCU/头。
G2—猪支原体肺炎活疫苗AN306株肺内免疫组
用灭菌生理盐水溶解AN306活疫苗冻干粉,使活疫苗终浓度为1×
107CCU/ml。
将1瓶168株活疫苗用5ml无菌猪支原体肺炎雾化活疫苗稀释液溶解稀释成1×
108CCU/ml浓度,取5ml疫苗溶液倒入喷雾器,对保温箱中的6头仔猪进行气雾免疫(0.2MPa,约10min)。
将1瓶168株活疫苗用25ml佐剂G-1-1溶液稀释成2×
107CCU/ml浓度,每头仔猪颈部肌肉注射免疫2.5ml,注射时分左右侧肌肉共2个注射点。
首免后14天二免,方法同上。
按猪支原体肺炎灭活疫苗说明书,每头猪肌肉注射免疫1头份猪支原体肺炎灭活疫苗。
按猪支原体肺炎乳兔活疫苗说明书,每头猪胸腔免疫1头份猪支原体肺炎活疫苗。
G8—健康对照
不免疫
G9—攻毒对照
2.2.4疫苗免疫后临床症状观察记录
免疫后观察并记录可能出现的临床症状,填写附录3。
尤其要记录如下重要的症状:
咳嗽、呼吸困难、俯卧、呕吐、食欲不振、震颤、死亡等
2.2.5疫苗免疫后血清抗体及分型检测
除攻毒对照组外,其余各组于免疫前、免疫后2、4、6周取3头猪各采血1ml(两次免疫组于首免前、首免后3、4、6周采血),分离血清,用自制P46-ELISA试剂盒检测IgG抗体。
对于阳性者继续用分型试剂盒检测IgG亚类。
2.2.6疫苗免疫后细胞免疫指标检测
除攻毒对照组外,其余各组于首免后2、4、6周取3头猪各采集抗凝血5ml(两次免疫组于免疫后3、4、6周采血),其中1ml用于血液生化检测;
1ml用流式细胞仪检测CD4+T细胞、CD8+T细胞含量、CD4+CD8+双阳性细胞、CD4+/CD8+比率;
另外3ml用于淋巴细胞增殖试验和IFN-γ检测
2.2.7疫苗免疫后黏膜免疫指标检测
除攻毒对照组外,其余各组于免疫前、首免后7、14、21、28、35、42天采集鼻拭子样品,检测吸呼道特异性sIgA抗体。
2.2.8攻毒
将每瓶猪肺炎支原体组织强毒用50ml生理盐水稀释,气管途径接种试验组试验猪,每头5ml。
2.2.9攻毒后临床症状观察
所有猪在攻毒后按附录2要求观察临床症状
2.2.10日增重计算
各组分别选定3头猪,不采集血样,分别于首免当天、攻毒当天和剖杀当天称重,计算日增重。
2.2.11攻毒后肉眼病变剖检
所有仔猪在攻毒后的第28天进行宰杀,记录肺病变,用28分法统计确定肺病变程度,并记算攻毒保护率(见附录1)。
2.2.12攻毒后病理损伤观察
剖杀后,采集所有猪左尖叶,福尔马列林溶液固定后,切片观察病理损伤。
2.2.13攻毒后肺部猪肺炎支原体抗原定量检测
剖杀后,每头猪用50ml生理盐水采集肺泡灌洗液,用定量PCR方法检测猪肺炎支原体抗原。
附录1攻毒保护率计算
攻毒保护率的统计与评判:
试验猪扑杀后,分别记录左尖叶、左心叶、左膈叶、右尖叶、右心叶、右膈叶、副叶病变百分比率,将0~25%记为1;
26~50%记为2;
51~75%记为3;
76~100%记为4,统计每个试验猪病肺病变指数(最高为28)。
试验猪病变指数大于10判为发病,小于4为健康(排除猪肺炎支原体感染),根据肺病变指数,按以下公式计算试验猪攻毒保护指数。
试验猪攻毒保护指数=(攻毒不免疫对照组肺病变指数平均值-试验猪肺病变指数)/(攻毒不免疫对照组肺病变指数平均值-不攻毒不免疫对照组肺病变指数平均值)%
试验猪攻毒保护指数小于60%为无保护,大于或等于60%为有保护,再按以下公式计算试验猪攻毒保护率。
试验猪攻毒保护率=有保护试验猪数/试验猪数
试验在阳性对照组全部发病、阴性对照组至少全部健康时有效。
附录2猪支原体肺炎发病猪临床症状评判标准
评判参数
1
2
10
最高分
咳嗽
无
有
严重
呼吸困难
呕吐
俯卧
严重(躺卧)
食欲不振
震颤
死亡
注射后第1日(D1)直肠温度高出范围
1.0℃以下
1.0℃~1.5℃
1.5℃以上
注射后第2日(D2)直肠温度高出范围
注射后第3日直肠温度较对照组高出范围
0.5℃以下
0.5~1.0℃
1.0℃以上
累计总分
28
猪安检试验中,每头试验猪症状全部累计,总分不大于2判为安全,累计总分大于5判为不安全,累计总分2~5,可重检1次,重检累计总分不大于2安全。
附录3动物分组记录表
猪场:
农科院
头数
标记
耳号
G1168肺内组
G2AN306肺内组
G3168气雾组
G4168肌注组
G5灭活苗组
G6乳兔苗肺内组
G7乳兔苗滴鼻组
G8健康对照
G9攻毒对照
附录4动物免疫记录表
动物免疫日期:
组
免疫途径
猪(头数)
操作人:
复核人:
附录5免疫后异常临床症状观察记录表
组:
猪数:
日期:
标记:
猪号
观察
日期
第几日
附录6抗体检测记录表
耳标
DPI14/21
DPI28
DPI42
IgG
亚类
附录7淋巴细胞增殖试验结果
附录8血象分析
附录9T淋巴细胞分类计数
附录10黏膜抗体检测记录表
附录11攻毒记录单
攻毒株:
批号:
来源:
稀释液:
在实验室稀释日期:
管(毒液)
批号
量
稀释
A
B
C
D
E
F
动物攻毒
日期:
攻毒途径
操作人:
复核人:
附录12特殊情况记录表
组:
隔离器:
观察:
签名:
-如有特殊情况,比如转群,疾病,用药,换料等影响动物的事件。
填写“附录12:
特殊情况记录”
注:
试验负责人员(SGQ,LMJ)应定期现场核查饲养情况,以及攻毒后的临床症状等,并在临床观察以及饲养记录上签字及日期。
及时将原始数据传递至JAAS,便于沟通。
附录13攻毒后临床症状观察记录表
临床症状记录与评分
症状类型
评分
附录14日增重记录
DPI0
DPI70
日增重
人重
总重
猪重
DPI0-42
DPI-0-70
附录15攻毒后肺部剖检记录
肺部照片
背侧面
腹侧面
附录16攻毒后剖检记录
肺叶病变指数
攻毒保护率
左尖叶
左心叶
左膈叶
右尖叶
右心叶
右膈叶
副叶
总分