茶成分检测技术和方法手册初稿Word格式.docx
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表2考马斯亮蓝SDS干扰实验表格……………………18
表2考马斯亮蓝SDS干扰实验表格……………………19
6.结论………………………………………………20
7.思考与讨论………………………………………21
二、游离氨基酸总量……………………………22
（一）茶游离氨基酸总量测定
1、范围………………………………………………22
2、引用标准…………………………………………22
3、定义…………………………………………………22
4、原理…………………………………………………22
5、仪器与用具…………………………………………22
6、试剂和溶液…………………………………………23
7、操作方法……………………………………………23
8、结果计算……………………………………………24
三、茶氨酸……………………………………………25
（一）茶叶中茶氨酸的测定高效液相色谱法
1、范围………………………………………………25
2、规范性引用文件…………………………………25
3、原理………………………………………………26
4、试剂………………………………………………26
5、仪器………………………………………………27
6、测定步骤……………………………………………27
7、分析结果的计算………………………………………29
8、精密度…………………………………………………30
第五章生物碱……………………………………………30
一、咖啡碱
（一）茶咖啡碱测定
1、范围………………………………………………………30
2、引用标准…………………………………………………31
第一法高效液相色谱法
3原理……………………………………………………………31
4仪器和用具……………………………………………………31
5、试剂和溶液…………………………………………………31
6、操作和方法…………………………………………………32
7、结果计算……………………………………………………33
第二法紫外分光光度法
8、原理…………………………………………………………34
9、仪器和用具……………………………………………………34
10、试剂和溶液……………………………………………………34
11、测定步骤………………………………………………………35
12、结果计算………………………………………………………35
第六章茶多酚…………………………………………………36
一、茶多酚总量
二、儿茶素总量
茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法
1、范围…………………………………………………36
2、规范性引用文件…………………………………………36
方法一茶叶中儿茶素类的检测——HPLC发
3、原理……………………………………………………36
4、仪器…………………………………………………36
5、试剂……………………………………………………36
6、操作方法………………………………………………37
7、结果计算………………………………………………40
方法二茶叶中茶多酚的检测
8、原理………………………………………………………42
9、仪器…………………………………………………………43
10、试剂…………………………………………………………43
11、操作方法………………………………………………………44
12、结果计算………………………………………………………44
13、注意事项………………………………………………………45
绪论
“贵州省都匀毛尖茶工程技术研究中心”（贵州省科技厅项目）子项目“都匀毛尖茶检测分析平台建设”的目标是建立都匀毛尖茶分析检测服务平台，规范毛尖茶产品质量管理体系，为毛尖茶生产企业提供相关检测服务。
本毕业论文（设计）拟编制《茶成分检测技术和方法手册》，以期为建设毛尖茶分析检测平台、检测毛尖茶有效成分提供指导。
第一章茶水分的测定
茶水分测定
TeaDeterminationofmoisturecontent
1范围
本标准规定了对茶叶中水分含量测定的原理、仪器与用具、操作方法及结果的计算方法
本标准适用于茶叶中水分的测定。
2引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。
本标准出版时，所示版本均为有效。
所有标准都会被修订.使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性
GB/T8302-2002茶取样
GB/T8303--2002茶磨碎试样的制备及其十物质含量测定
3定义
本标准采用下列定义。
水分moisturecontent
在常压条件下，试样经规定的温度加热至恒重时的质量损失
4原理
试样于103℃士2℃的电热恒温十燥箱中加热至恒重，称量。
5仪器与用具
实验室常规仪器及下列各项:
5.1铝质烘皿:
具盖，内径75mm-80mm,
5.2鼓风电热恒温干燥箱:
能自动控制温度士2℃。
5.3干燥器:
内盛有效干燥剂
5.4分析天平:
感量0.001g
6操作方法
6.1取样
按GB/T8302规定取样。
6.2试样制备
紧压茶按GB/T8303--2002中6.2.2规定制备茶样。
紧压茶以外的茶，按6.1取样操作，将样品
混匀。
6.3铝质烘皿的准备
将洁净的烘皿连同盖置于103℃士2℃的干燥箱中，加热1h，加盖取出，于干燥器内冷却至室温称
量（准确至0.001g）.
6.4测定步骤
6.4.1第一法—103℃恒重法（仲裁法）
称取5g（准确至0.001g）试样（6.2）于已知质量的烘皿（6.3）中，置于103℃土2℃干燥箱（5.2）内（皿盖斜置皿上）。
加热4h，加盖取出，于干燥器（5.3）内冷却至室温，称量。
再置干燥箱中加热1h，加盖取出，于干燥器内冷却，称量（准确至0.001g）。
重复加热1h的操作，直至连续两次称量差不超过0.005g,即为恒重，以最小称量为准。
6.4.2第二法—120℃烘干法（快速法）
称取5g（准确至0.001g）试样（6.2）于已知质量的烘皿（6.3）中，置120℃干燥箱（5.2）内（皿盖斜置皿上）。
以2min内回升到120℃时计算，加热1h，加盖取出，于干燥器（5.3）内冷却至室温，称量（准确至0.001g）。
7结果计算
7.1计算方法
茶叶水分以质量分数表示，按式
（1）计算。
×
…………
（1）
式中:
M1—试样和铝质烘皿烘前的质量，g;
M2一一试样和铝质烘皿烘后的质量，g;
M0—试样的质量，g.
如果符合重复性（7.2）的要求，取两次测定的算术平均值作为结果（保留小数点后一位）。
7.2重复性
同一样品的两次测定值之差，每100g不得超过0.2g
●注:
用第二法侧定茶叶水分，重复性达不到要求时，按第一法规定进行测定。
第二章茶总灰分的测定
茶总灰分测定
Tea—Determinationoftotalashcontent
本标准规定了对茶叶中总灰分测定的原理、仪器和用具、测定步骤及结果计算方法。
本标准适用于茶叶中总灰分的测定。
GB/T8302—2002茶取样
GB/T8303—2002茶磨碎试样的制备及其干物质含量的测定
总灰分tatalash
在规定的条件下，茶叶经525℃±
25℃灼烧灰化后所得的残渣。
试样经525℃±
25℃加热灼烧，分解有机物至恒量。
5仪器和用具
实验室常规仪器及下列各项：
5．1坩埚：
瓷质、高型，容量30mL。
5．2电热板。
5．3高温电炉：
525℃±
25℃。
5．4干燥器：
内盛有效干燥剂。
5．5坩埚钳。
5．6分析天平：
感量0.001g。
6测定步骤
6．1取样
按GB/T8302的规定。
6．2试样制备
按GB/T8303的规定。
6．3坩埚的准备
将洁净的的坩埚置于525℃±
25℃高温炉内，灼烧1h，待炉温降至300℃左右时，取出坩埚，于干燥器内冷却至室温，称量（准确至0.001g）。
6．4测定
称取混匀的磨碎试样2g（准确至0.001g）于坩埚内，在电热板上徐徐加热，使试样充分炭化至无烟。
将坩埚移入525℃±
25℃高温炉内，灼烧至无炭粒（不少于2h）。
待炉温降至300℃左右时，取出坩埚，置于干燥器内冷却至室温，称量。
再移入高温炉内以上述温度灼烧1h，取出，冷却，称量。
再移入高温炉内，灼烧30min，取出，冷却，称量。
重复此操作，直至连续两次称量差不超过0.001g为止。
以最小称量为准。
6．5必要时，可保留总灰分供测水溶性灰分和水不溶性灰分。
茶叶总灰分以干态质量分数表示，按式
（1）计算
总灰分（%）=（M1-M2）/（Mo×
m）×
100…………
（1）
式中：
M1——试样和坩埚灼烧后的质量，g；
M2——坩埚的质量，g；
Mo——试样质量，g；
m——试样干物质含量，%。
如果重复性符合（7.2）的要求，取两次测定的算术平均值作为结果（保留小数点后一位）。
7．2重复性
同一样品的两次测定值之差，每100g试样不得超过0.2g。
第三章茶水浸出物的测定
茶水浸出物测定
Tea-Determinationofwaterextractscontent
本标准规定了对茶叶中水浸出物测定的原理、仪器和用具、操作方法及结果计算方法。
本标准适用于对茶叶中水浸出物的测定。
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。
所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。
GB/T8302一2002茶取样
水浸出物waterextracts
在规定的条件下，用沸水浸出茶叶中的水可溶性物质。
用沸水回流提取茶叶中的水可溶性物质，再经过滤、冲洗、于燥、称量浸提后的茶渣，计算水浸出物。
5.1鼓风电热恒温干燥箱:
温控120℃士2℃.
5.2沸水浴
5.3布氏漏斗连同抽滤装置
5.4铝盒具盖内径75mm-80mm,
5.5于燥器:
5.6分析天平:
感量0.001g.
5.7锥形瓶:
500ml,
5.8磨碎机:
由不吸收水分的材料制成;
死角尽可能小，易于清扫;
内装孔径为3mm的筛子
按GB/T8302的规定。
先用磨碎机（5.8）将少量试样磨碎，弃去，再磨碎其余部分。
6.3铝盒准备
将铝盒（5.4）连同15cm定性快速滤纸置于120℃±
2℃的恒温干燥箱（5.1）内，烘干1h，取出，在干燥器内（5.5）冷却至室温.称量（精确至0.001g）。
称取2g（准确至0.001g）磨碎试样（6.2）于500mL锥形瓶（5.7）中乍加沸燕馏水300mL，立即移入沸水浴（5.2）中浸提45min（每隔10min摇动一次）。
浸提完毕后立即趁热减压过滤（用经6.3处理的滤纸）。
用约150ml一沸蒸馏水洗涤茶渣数次，将茶渣连同已知质量的滤纸移人铝盒（6.3）内，然后移入120℃±
2℃的恒温干燥箱（5.1）内烘1h，加盖取出冷却1h再烘1h，立即移人干燥器（5.5）内冷却至室温，称量。
茶叶中水浸出物以干态质量分数表示，按式
（1）计算:
M。
一试样质量，g;
m1--干燥后的茶渣质量，g;
m—试样千物质含量，%。
如果符合重复性（7-2）的要求，取两次测定的算术平均值作为结果，结果保留小数点后一位.
同一样品的两次测定值之差，每100g试样不得超过0.5g
第四章蛋白质和氨基酸
一、蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法
1.[实验目的]
学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量的方法
2.[实验原理]
此方法是1976年Bradform建立。
考马氏亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与595nm的吸光度成正比
3.[器材与试剂]
器材
722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支
试剂
1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA），配制成1.00mg/ml。
2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：
称100mg考马斯亮蓝，溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀释至1升。
4.[实验方法]
标准方法
1.取10支试管，分别编号后按表1剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm处测量吸光度A595。
3.用标准蛋白浓度（mg/ml）为横坐标，用A595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。
根据测得的未知样品的A595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。
根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算:
样品蛋白质含量（μg/g鲜重）=
SDS干扰实验
1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS、去离子水和考马斯亮蓝染料。
2.加完染料20min后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm处测量吸光度A595。
5.[实验数据与结果分析]
（一）标准方法的数据和图
表1考马斯亮蓝标准法实验表格
管号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
标准蛋白质
（1.0g/ml）
0.01
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
未知蛋白质
（约0.5mg/ml）
蒸馏水
0.1
0.09
考马斯亮蓝
G-250试剂
3.0
对应的吸光度A595
根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。
图1考马斯亮蓝标准法
根据线性拟合公式y=ax+b计算所测溶液的蛋白质的含量。
（二）SDS干扰数据和图
表2考马斯亮蓝SDS干扰实验表格
（1.00mg/ml）
SDS（1mg/ml）
0.2
0.4
0.6
0.8
0.9
0.7
0.5
0.3
根据表2，以A595为纵坐标，SDS浓度为横坐标，作图2。
图2考马斯亮蓝SDS干扰实验
理论上，十二烷基硫酸钠（SDS）对考马斯亮蓝法测蛋白质含量有干扰，随着SDS浓度的增加，其混合液的595nm处的吸收峰逐渐降低，而后有一小段回升，最后趋于渐近线。
6.[结论]：
1．考马斯亮蓝标准法测得未知溶液中蛋白质含量为xmg/ml。
2．干扰考马斯亮蓝方法的物质中，SDS的干扰分析情况。
[干扰实验结果分析]：
当溶液中存在一定量的SDS后所测得的吸光度比正常值相对减小。
但是随着SDS浓度的增加，吸光度的减小量应没有呈现出很明显的规律。
从SDS与蛋白质的作用机理来看，SDS可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构。
SDS和蛋白质结合后使蛋白质-SDS复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸结合一个SDS分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。
由于SDS的存在，阻碍了染料与碱性氨基酸和芳香族氨基酸的结合，使得吸光度减小。
由于SDS与染料分子对蛋白质的竞争结合，使得显色减弱，吸光度值降低，因此在曲线前段呈下降趋势；
但由于SDS破坏氢键，使得蛋白质的空间结构更加伸展，一些原来包裹在结构中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸暴露出来，所以会有少量的吸光度回升；
但最终SDS与蛋白质的结合达到所处溶液条件下的“饱和”时，过量的SDS就不起作用了，曲线是最后为平缓段。
要去除SDS的干扰，可以利用它与K+结合生成沉淀的性质将其去除。
K+对考马斯亮蓝方法不产生干扰。
7.[思考与讨论]
1.用考马斯亮蓝法G-250测定蛋白质含量有何特点，操作过程中应注意什么？
2.考马斯亮蓝G-250和R-250各有何特点，在电泳染色方面有何异同？
3.试述几种主要干扰物质对考马斯亮蓝G-250蛋白测定法测定结果的影响及其作用机理。
4.说明各种蛋白质含量测定法中哪几种可以测出蛋白质的绝对含量，哪几种只能测定其相对含量，为什么？
二、茶游离氨基酸总量测定
本标准规定了对茶叶中游离氨基酸总量测定的原理、仪器和用具、试剂和溶液、操作方法及结果计算方法
本标准适用于茶叶中游离氨基酸总量的测定。
GB/T8302-2002茶取样
GB/T8303-2002茶磨碎试样的制备及其干物质含量测定
GB/T8312-2002茶咖啡碱测定
GB/T8313-2002茶茶多酚测定
游离氨基酸freeaminoacids
茶叶水浸出物中呈游离状态存在的具有。
一氨基的有机酸。
a-氨基酸在pH8.0的条件下与茚三酮共热，形成紫色络合物，用分光光度法在特定的波长下测定其含量。
实验室常规仪器及下列各项
5.1分析天平：
感量0.001g
5.2分光光度仪。
6试剂和溶液
所用试剂应为分析纯（AR），水为蒸馏水。
6.1pH8.0磷酸盐缓冲液:
按GB/T8313---2002中6.2的规定，配制1/15mol/I磷酸氢二钠（6.2.1）和1/15mol/I磷酸二氢钾（6.2.2）溶液。
然后取1/15mol/I_的磷酸氢二钠溶液95ml_和1/15mol/I磷酸二氢钾溶液5ml，混匀。
6.22%茚三酮溶液:
称取水合茹二酮（纯度不低于99）2g，加50mL水和80mg氯化亚锡（SnCl·
2H20）搅拌均匀。
分次加少量水溶解，放在暗处，静置一昼夜，过滤后加水定容至100ml。
6.3茶氨酸或谷氨酸标准液:
称取100mg茶氨酸或谷氨酸（纯度不低于99%）溶于100mL水中，作为母液。
准确吸取5ml母液，加水定容至50mL作为工作液（1ml含茶氨酸或谷氨酸0.1mg）。
7操作方法
7.1取样
按GB/T8302的规定
7.2试样制备
按照GB/T8303的规定。
7.3测定步骤
7.3.1试液的制备
按GB/T8312-2002中11.1的规定。
7.3.2测定
准确吸取试液（7.3.1）1mL，注人25mL的容量瓶中，加0.5mLpH8.0磷酸盐缓冲液（6.1）和0.5mL2%环茚三酮溶液（6.2），在沸水浴中加热15min。
待冷却后加水定容至25mL。
放置10min后，用5mm比色杯，在570nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度（A）。
7.3.3氨基酸标准曲线的制作
分别吸取0.0,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0mL氨基酸工作液（6.3）于一组25mL容量瓶中，各加水4ml、pH8.0磷酸盐缓冲液（6.1）0.5ml和2%茚三酮溶液（6.2）0.5ml,，在沸水浴中加热15min，冷却后加水定容至25ml，按7.3.2的操作测定吸光度（A）。
将测得的吸光度与对应的茶氨酸或谷氨酸浓度绘制标准曲线。
8结果计算
8.1计算方法
茶叶中游离氨基酸含量以干态质量分数表示，按式
（1）计算
L1—试液总量,mL
L2一测定用试液量,mL;
M0-—试样量，g
C一根据7.3.2测定的吸光度从标准曲线上查得的茶氨酸或谷氨酸的毫克数;
m一一试样干物质含量，%。
如果符合重复性（8.2）的要求，则取两次测定的算术平均值作为结果，结果保留小数点后一位。
8.2重复性
同一样品的两次测定值之差，每100g试样不得超过0.1g
三、茶氨酸
（
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