NFKB的激活与检测方法doc11页完美版Word格式文档下载.docx
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repeatmotif)的前体蛋白p105和p100通过ATP依赖蛋白水解过程裂解而形成。
该类蛋白含有RHD,但缺乏转录活性
区,无独立激活基因转录的功能。
另一类为p65(RelA),Re(lc-Rel),RelB和果蝇的dorsal、Dif和Relish,它们没有前体,除N端的RHD夕卜,?
其C-端有一个或多个转录活性区,具有直接作用转录设备而激活基因转录的功能。
除RelB外,其他成员在体外都可形成同二聚体或异二聚体,RelB只能形成由p50或p52组成的二聚体。
1.2NF-kB的抑制蛋白IkB和IKK
在没有刺激的细胞中,大部分的NF-kB二聚体通过与细胞质中三个抑制因子(IkBu、IkB氏IkBe)中的一个结合而以无活性的状态存在【4】。
目前研究发现IKBs共有7种结构类型,在哺乳动物中最重要的IkBs是IkBu、IkB仇IkBe且只有这3种IkB含有在外界信号刺激下被降解的N-末端调控区域【5】。
它们共同的结构特征是在c端有一个特征性的锚蛋白重复序列。
IkBu影响并屏蔽位于RHD末端的核定位信号,研究证明,虽然不同的外界刺激通过作用于不同的IkB引起NF-kBW差别地活化【6】,但几乎所有已知NF-kB诱导物均能通过IkBu的降解迅速而短暂地活化NF-kB,同时IkBu不仅阻止已转移激活二聚体的DNA结合,而且裂解他们同源DNA位点前体复合物。
IkB銅IkB则起到缓冲系统活化波动趋势的作用,从而保持NF-kB有一个相对较长时间的响应。
【5】
I-KB激酶IKK是I-KB离开NF-KB并使之得以活化的必需前提,随之降解抑制因子I-KBoIKK是由一个调节亚单位,IKK-丫也被称为NEMO)和两个催化亚单位IKK-a,IKKB组成。
IKKa和IKKB属于丝/苏氨酸蛋白激酶,而NEM虽包含有多个蛋白反应基序但却无明显的催化区。
在经典的NF-KB激活途径中,IKK0的活化起到了非常重要的作用。
IKKB基因敲除实验证实小鼠在缺乏IKKB情况下,不仅影响NF-kB激活通路,而且由于不能控制大量肝细胞凋亡而在胚胎期出现死亡,这些小鼠在炎症细胞因子作用时,NF-KB激活通路出现障碍,
由此说明,IKKB是促炎症反应因子刺激诱导NF-kB活化的主要激酶,IKKB在NF-kB激活通路中可能比IKKa更重要【7】。
IKKa不只是传统的认为只是I-kB激酶,而且以其他的方式影响着基因的表达。
DEVINEYAMAMOTO【8-9】研究认为IKKa可作用于IKK吸其上游区而直接或问接增加IKK附IKBa的磷酸化作用,从而影响NF-KB基因的激活表达。
Sankarghosh和matthews.hayden发现IKKa限制了促炎症巨噬细胞的反应【10】。
2.NF-KB的激活
细胞处于静息状态时,NF-KB-IKBs复合物(NF-KB-IkBa、NF-kB-IkBe)在胞浆与胞核之间穿梭,处于动态平衡。
各种信号通过降解IkBs的方式来活化NF-kB,活化的NF-kB然后进入细胞核内与DNA结合。
IkBs首先是在IkBs激酶(IKK)催化下使其的32和36
位丝氨酸残基磷酸化。
接着IkBs在SCF-E3泛素化酶复合体的催化作用下多泛素化而被蛋白酶降解。
活化的NF-kB转位到核内与其相关的DNA基序结合以诱导靶基因的转录。
这种方式的NF-kB活化途径被
称为经典的NF-kB活化途径。
NF-kB通过该途径调节的目的基因有炎症介质、细胞因子(如TNF-aIL-1等)、黏附分子、急性期蛋白及可诱导的效应期酶等。
其他的不被人所熟知的途径也能从IkBs中活化部分的NF-kB。
这些途径包括酪氨酸磷酸化诱导的IkBs解离途径途径和蛋白激酶-2诱导的IkBs的流动加快的方式。
释放后的NF-kB可以通过例如修饰自身的亚单位的方式来影响自身的转录激活效能。
活化的NF-kB快速的
诱导编码IkBa的基因的转录,因此产生高水平的自身抑制剂。
新合成的自由的IkBa进入细胞核内,然后使DNA上NF-kB解离并且将NF-kB排出细胞核,因而恢复到静息状态。
3.生物学功能
3.1NF-kB与细胞凋亡
3.1.1抗凋亡的作用
最初,Be^【11】在1995年发现缺乏RelA亚单位的鼠在胚胎期的死亡主要是因为肝细胞大量凋亡引起的提示含有RelA的NF-kB二聚体在胚肝中可以保护细胞不受促凋亡基因的影响:
实验表明,缺乏NF-kB/Rel基因或含有NF-kB/Rel抑制剂的培养细胞在受到TNF或T细胞激活剂刺激时易发生凋亡【12】。
在B淋巴细胞系中也可发现NF-kB的抗凋亡作用。
这些细胞系表
达一定活性NF-KB,若被灭活则可诱导凋亡。
当成熟B淋巴细胞被NF-kB活性抑制剂或抗氧化剂处理时,就发生了细胞凋亡。
因此B细
胞中一定水平的NF-kB对于保证细胞存活及增殖有重要的作用【13】。
目前,NF-kB主要通过以下三条途径来抑制凋亡【14】。
(1)NF-kB通过上调编码抗凋亡的细胞因子的基因表达来抑制凋亡。
M^【15】发现在白细胞介素一6(IL—6)的启动子上有NF-kB的结合位点,TNF-a,辐射等通过激活NF-kB而上调IL-6的基因表达。
同样的,研究者们也发现在IL-1,IL-2,巨噬细胞集落刺激因子(M—CSF等细胞因子上游启动子序列中均含有NF-kB的结合位点【16】。
(2)NF-kB通过诱导或上调抗凋亡基因抑制凋亡。
公认的抗凋亡
蛋白Bel—xl是Bel—2家族中bel—XS因的表达产物。
Herramnn等
【17】发现在该基因的启动子中也含有2个与NF-kB优先结合的序列。
Wan等发现NF-kB能够通过激活bcl-2家族中的A1/Bfl一1而抑制了由TNF-a引起的凋亡。
(3)NF-kB®
过诱导TRAF(TN受体相关因子)和IAP(凋亡抑制蛋
白)抑制凋亡【18】。
TRAI与其相应的配体TNF结合后,在诱发细胞凋亡的同时,激活细胞内NF-kBoNF-kB抗凋亡机制是作用于Caspase-8和线粒体的上游,进一步研究表明,NF-kB在基因和蛋白表达两个水平上控制了TRAI一1、TRA一2、e—IAP1、e—IAP2的表达,从而抑制了Caspase-8的活性。
而Caspase-8是接到死亡受体相关信号必须的凋亡蛋白酶,它的活化是TNI诱发细胞凋亡途径中关键的一环。
此途径也是NF-kB抗细胞凋亡的重要机制。
3.1.2促凋亡的作用
然而,在另外一些实验研究中人们看到了与上述实验结果相反的
数据。
例如,Trede等【19】用鬼臼亚乙苷作用于人T细胞和早幼粒白血病细胞,可活化NF—KB并诱导细胞凋亡。
谷氨酸诱导的神经元细胞的毒性伴随着NF-kB的诱导,NF-kB的激活引起了细胞死亡。
实验显示,辛德毕斯(Sindbis)病转染的细胞,在细胞凋亡的起始阶段甚至需要NF-kB的参与【20】。
滕伟禹等人证明Toll样受体4介导的NF-kB信号途径参与了脑内出血的致病机制,且证明脑内出血后存在细胞凋亡,可能与NF-kB的激活有关【21】。
3.2对炎症作用
炎症是机体抵御病原体入侵的一种机制。
它是一个复杂的生物过程,包括一些细胞因子的合成与释放。
NF-kB参与炎症反应。
NF-kB可以高效诱导炎症细胞因子(TNF-a、IL-1、IL-6等)、趋化因子、黏附分子(ICAM-1、VCAM-1)炎性酶(iNOS、COX-2)等的基因表达,对炎症反应级联放大,在多种炎症性疾病的炎症部位高度活化。
因此NF-kB是许多炎症细胞因子的转录因子,在炎症反应中起着主要作用。
4.检测方法
4.1.蛋白印迹(Westernblot)
可以从两个方面应用Westernblot进行检测,一是NF-kB的表达量,生理条件下NF-kB存在一定量表达,疾病及各种外源刺激下NF-kB表达量发生异常改变;
二是可以检测细胞质中IkB的降解,细胞未受到任何刺激时,细胞质中的NF-kB处于未活化状态,NF-kB/I-KB复合物以无活性方式将NF-KB滞留于胞浆,当细胞受到外界因素刺激时,NF-kB与IkB分离,NF-kB进入细胞核,IkB则被降解。
Westernblot可以反映NF-kB蛋白表达量的变化情况,从而可作为研究其功能的一种手段。
Westernblot检测NF-kB简便经济,不需要特殊仪器,操作简单,耗时少,是目前检测NF-kB常用的一种方法。
不足之处是不能直接反映NF-kB活性,而且部分转录因子功能改变时,只是由于活性变化所引起,蛋白总量并不发生改变,Westernblot不能反映出这种由于活性改变引起的NF-kB功能变化,其特异性也有待进一步提高【22】。
4.2凝胶迁移滞留实验(electrophoreticmobilityshift
assay,EMSA)
EMS是目前用于检测NF-kB的DN嶠合活性应用最多的方法,已成为检测NF-kB结合活性的经典方法【23】。
EMS原理:
带标记的与NF-kB有共有序列的寡聚核苷酸探针结合到NF-kB后,因其分子量和表面电荷发生改变,在非变性条件下行凝胶电泳,其泳动率比未结合的游离探针慢,经自显影后即可检测TF活性。
结合凝胶图像分析系统,可实现定量检测。
EMS根据所用标记物的不同分放射性和非放射性两种。
放射性EMSA敏感性高,而且特异性强。
非放射性EMS勿需经过放射显影,采用生物发光或化学发光原理进行检测,敏感度与放射性EMS相近。
EMS已广泛应用于NF-kB活性检测,但其本身也存在一定缺点,如对于低亲和力结合很难进行鉴定,难以比较不同片段之间亲和力大小的差异;
对于蛋白复合体与DNA勺结合也无法鉴定等。
由于体内外环境存在巨大差异,EMSA目前很难真正重建体内蛋白质与DNA之间结合过程【22】。
4.3ELISA为基础的检测方法
这是一种以ELISA为基础的试剂盒来检测并定量转录因子的活动的检测方法。
试剂盒内有一个96孔板,含有NFkB固有序列结合位点的寡核苷酸已经被固定在板上。
包含在细胞核或全细胞提取物中的的激活的NFkB同源二聚体和异源二聚体特异的结合在寡核苷酸上。
通过使用直接与转录因子p65,p50,p52,c-Rel或者RelB亚基配对的抗体,活化的转录因子亚基结合到寡核苷酸而被检测到。
第二抗体与辣根过氧化物酶共轭结合后提供了敏感的显色反应,这可以方便的用分光光度法定量测定。
此试剂盒是一个快速,使用方便且敏感特异的试验方法。
4.4报告基因分析系统检测
另一种检测NF-kB活性的方法是以报告基因为基础的检测方法,如荧光素酶或B—半乳糖苷酶等。
报告基因分析系统(reportergeneassay)的建立,给NF-kB的转录活性评价带来了极大方便。
(1)[3一半乳糖苷酶(3-galatosidase,3-ga1)报告基因:
大肠杆菌编码的3-gal可以水解乳糖生成半乳糖,分光光度计检测颜色改变可反映转录活性。
3-gal基因现常用作转染的参照体系。
(2)荧光素(1uciferase,luc)报告基因:
luc能催化甲虫的荧光素产生氧化性羧化作用,发射出光子,能被光度计或闪烁计数器捕获定量。
luc分析具有快速、方便,具有很好的浓度线性范围(具有7〜8个数量级的线性范围),而被广泛应用【24】。
(4)绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP报告基因:
GF在紫外光下发射荧光,其荧光强度和蛋白表达量呈正相关,可以被多种方法检测。
该报告基因检测不需要底物,GFP表达稳定,加热、变性剂、去垢剂及一般的蛋白酶均不能使它灭活【22】。
结合全自动定量绘图酶标仪或聚焦显微镜,还可对转录调节因子进行高通量分析口【25】。
GFP艮告基因的另一个优点是可以在活细胞条件下检测以及细胞内定位【26】。
报告基因分析在体内环境下直接测定转录活性水平,真实反映转录因子的生物学活性,并且可以进行定量分析,是目前检测NF-kB的一种比较理想方法。
结语
自1986年首次发现NF-kB以来,围绕它的研究日益深入。
目前,对NF-kB在肿瘤细胞中生物学特性的研究是一个热点问题,并且也取
得了一些研究进展。
NF-kB参与机体的细胞分化、免疫反应、胚胎发生、细胞凋亡及病毒感染等多种重要的生理和病理反应因此受到国内外学者的关注。
因此,对NF-kB进一步的研究,对其激活和抑制机理的了解,将有助于治疗炎症,癌症等各种疾病。
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多了一次失败,就多了一次教训;
多了一次挫折,就多了一次经验。
没有失败和挫折的人,是永远不会成功
的。