生物技术制药重点及名词解释文档格式.docx

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在基因克隆中要使用甲基化酶缺陷型细菌菌株制备质粒DNA。

♦酶切反响的温度

♦DNA的分子结构

♦反响缓冲液组成

♦反响时间、反响体积等

工具酶

✦核酸限制性内切酶：

识别、水解外源的双链DNA分子上特定的核苷酸序列。

主要存在于原核微生物中。

•同裂酶：

指来源不同，识别序列一样的酶；

进展同样的切割，产生一样的末端

•同尾酶：

来源不同，识别序列不同，但产生一样的粘性末端

DNA甲基化酶：

具有宿主专一性，对宿主自身DNA上特定核苷酸进展甲基化修饰，防止被自身限制性内切酶水解

✦DNA连接酶

•T4噬菌体连接酶：

连接双链DNA切口，或带粘性末端或平头末端的DNA片段

•大肠杆菌DNA连接酶：

连接双链DNA切口，或带粘性末端的DNA片，不能连接带平头末端的DNA片段

✦聚合酶：

以DNA或RNA为模板，将核苷酸连续加至3’-OH末端，合成方向为5’→3’。

DNA聚合酶、RNA聚合酶

•大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ：

5’→3’DNA聚合酶活性；

5’→3’DNA外切酶活性；

3’→5’DNA外切酶活性；

RNAH酶活性

•Klenow酶：

不具备5’→3’DNA外切酶活性

•T4噬菌体DNA聚合酶：

不具备5’→3’DNA外切酶活性。

外切酶活性比Klenow酶强200倍，对单链DNA作用强于双链DNA

•T7噬菌体DNA聚合酶：

•TaqDNA聚合酶

•反转录酶：

催化以RNA或DNA为模板，合成DNA；

具有RNAH酶的活性

•末端脱氧核苷酸转移酶：

催化dNTP沿5’→3’聚合，逐个加于线性DNA分子的3’末端；

不需要模板

载体：

（vector）来源于质粒、噬菌体或病毒的DNA分子，可供插入或克隆目的基因或DNA，并具有运载外源DNA导入宿主细胞的能力。

✦质粒载体：

共价闭合环状DNA（cccDNA）；

开环DNA（ocDNA）；

线状DNA（lDNA）

•质粒的三个重要性质：

遗传传递的能力；

遗传交换的能力；

不相容性

•用于克隆的质粒的三个要素：

复制子、选择标记、多克隆位点

•常用质粒载体：

克隆载体、表达载体、突变载体、报告载体

✦λ噬菌体载体：

插入型载体、置换载体

•来源于噬菌体DNA，因可以插入较大DNA片段，常用于构建基因组文库和cDNA文库。

目的基因的常用制备方法

✦化学合成法：

前提：

基因的DNA的序列。

小于100bp的片段：

直接合成，最常用固相亚磷酸三酯法。

大片段目的基因：

小片段粘接法、大片段酶促法

✦PCR法：

待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反响必需的双引物。

✦基因文库法：

鸟枪法：

适用于原核细菌目的基因的克隆别离

✦cDNA文库法（与mRNA互补的DNA）并非所有的mRNA分子都具有polyA结构；

仅限于克隆蛋白质编码基因；

mRNA含量少且t1/2短，对酶和碱极为敏感，别离纯化困难

第一链：

mRNA模板，引物（polyT），逆转录酶，dNTPs

第二链：

自身引导法：

取得的双链cDNA5’端会有几对碱基缺失（NaOH，煮沸；

Klenow酶，dNTPs；

S1内切酶）

引导合成法：

获得的cDNA能保持完整的5’端序列（TdT,Dctp；

NaOH；

退火；

Klenow酶，dNTPs）

♦基因文库的完备性：

指在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：

N=ln（1–P）/ln（1–f），P=完备性，f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小

♦双酶切产生的粘性末端，最常用，可以确保连接方向的正确性

♦影响连接效率的因素：

连接方式；

目的基因与载体的浓度比例摩尔数比大于1；

连接温度、时间、酶的活性、反响缓冲体系

重组DNA导入宿主细胞

✦导入大肠杆菌：

CaCl2法；

转染法

✦导入酵母：

电转化法；

化学转化法；

原生质转化法

✦导入链霉菌：

原生质转化法；

电穿孔法

✦重组DNA导入哺乳动物细胞：

显微注射法；

DEAE葡聚糖转染法；

DNA-磷酸钙转染法；

阳性脂质体介导法；

电穿孔法；

细胞融合法；

病毒感染法

重组子的筛选与鉴定

✦遗传标记筛选法：

抗生素抗性筛选法；

α互补筛选法（蓝白斑筛选——载体含有LacZα基因，X-gal培养基，成功导入的菌落显示为蓝斑）；

营养缺陷型筛选法；

噬菌斑筛选法

✦核酸分子杂交法：

菌落原位杂交法；

DNA印迹法；

RNA印迹法

✦限制性内切酶图谱法：

琼脂糖凝胶电泳鉴定各片段分子量，含有目的基因的为阳性克隆

✦DNA序列测定法

✦目的基因表达产物测定法

原核细胞表达的特点与选择

✦大肠杆菌（首选,遗传背景研究清楚；

适合大规模生产（本钱低，周期短，效率高，操作简单）、芽孢杆菌、链霉菌等

✦缺点：

缺乏翻译后修饰系统；

容易以包涵体形式存在；

外源蛋白容易被宿主酶系统水解

★外源基因表达的调控原件：

复制子、启动子（表达效率的关键因素）和终止子、核糖体结合位点（即SD序列与SD序列到起始密码子AUG的距离）、识别翻译后修饰信号

✦用于原核表达的载体必须具备的条件：

具有复制子、灵活的克隆位点和方便的选择标记、很强的启动子、阻遏子（一般有）、强的终止子，所产生的mRNA应具有翻译起始信号（起始密码子AUG以与SD序列）

★外源基因在大肠杆菌中的表达方式

✦胞内表达：

非融合蛋白表达：

蛋白质接近天然状态，易被降解，易形成包涵体。

有原核多肽基因

融合蛋白表达：

表达效率高；

产物稳定；

可以切除原核多肽，获得天然外源蛋白

✦分泌表达：

有信号肽基因，形成周质表达或细胞外表达

★外源蛋白表达效率的影响因素

✦外源基因密码子：

大肠杆菌具有偏好密码子和稀有密码子，外源基因应尽量设计成为大肠杆菌的偏好密码子

✦mRNA的结构：

改变一级结构；

降低5’端二级结构稳定性；

调控3’端非翻译区二级结构

✦表达载体的选择：

表达方式；

强的复制子（拷贝数高）；

强的启动子（转录效率高）；

高效率的核糖体结合位点；

强的终止子（提高mRNA稳定性）；

适应X围广；

稳定性高；

产物易纯化。

✦外源蛋白的稳定性：

采用融合蛋白形式表达；

采用蛋白酶缺陷的突变菌株

真核细胞表达的特点与选择

常用的真核表达系统：

酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统

大肠杆菌和酵母表达系统的比拟

大肠杆菌

巴斯德毕赤酵母

载体

原核载体

穿梭载体

调控序列

原核

原核和真核

表达形式

包涵体、融合蛋白、分泌

分泌

翻译后修饰

根本无

有

生产方式

发酵，操作简单、经济

发酵，操作较简单、较经济

★酵母表达体系的影响因素

✦外源基因的结构

©

外源基因5’端非翻译区的序列和长度影响mRNA的翻译效率

起始密码子两侧假如容易形成RNA二级结构，将阻止翻译进展

富含A-T序列导致转录提前终止

密码子的偏好性

高度复杂的胱氨酸结构基序影响表达效率

✦表达形式与信号肽的选择：

无信号肽常胞内表达；

有信号肽，胞外分泌型表达

✦启动子：

多数毕赤酵母采用乙醇氧化酶AOX1、AOX2启动子

✦转化子的拷贝数：

拷贝数越高，表达水平也越高

✦诱导条件：

甲醇诱导的浓度、时间以与温度的选择

✦外源蛋白的降解：

采用酶缺陷型宿主、参加底物蛋白或调节pH值抑制蛋白酶活性，提高外源蛋白的稳定性。

哺乳动物细胞表达系统

✦表达载体：

病毒载体（腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒等）；

质粒载体

✦表达方式：

瞬时表达、稳定表达、诱导表达

基因重组蛋白的主要别离技术：

离心、沉淀（等电点沉淀法、盐析法）、膜别离、双水相萃取

基因重组蛋白的主要纯化技术：

离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析、反相色谱和疏水色谱

选择别离纯化方法的依据

✦根据表达形式选择

♦分泌型：

沉淀和超滤

♦周质表达：

溶菌酶处理＋渗透压休克

♦胞内可溶表达：

亲和层析或离子交换层析

♦胞内不溶表达（包涵体）：

易与杂蛋白分开，但需要复性形成有活性的蛋白质。

✦根据别离单元之间的衔接选择

♦先采用低分辨、别离规模大的方法，后采用高分辨的方法，最后采用别离规模小、速度慢的方法。

合理选择色谱别离次序

✦根据别离纯化工艺的要求选择

♦具有良好的稳定性、重复性和较高的安全性；

尽量较少组成工艺步骤；

所用时间尽可能短；

工艺和技术必须高效

★基因工程药物的质量控制与小分子药物质量控制相比，不同的方面

✦Mr远大于小分子化学物质，致使适用于小分子药物的鉴别方法无法用于基因工程药物。

如质谱

✦基因工程药物结构复杂，常需多种检测方法

✦两者杂质性质差异较大。

小分子药物杂质主要来源于合成中原料残留、合成副产物和纯化中溶剂残留；

基因工程药物多为宿主蛋白残留和宿主基因残留，其检测一般都用专用的试剂盒。

✦药物定量方面，基因工程药物一般采用生化反响的方式

★基因工程药物的质量控制

1、蛋白质含量的测定

✦紫外吸收光谱：

在280nm有最大吸收值。

快速，无破坏性。

不是严格定量，核酸可引起强干扰作用。

✦BCA法：

碱性条件与Cu2＋络合同时将Cu2＋复原成Cu＋（双缩脲反响），再与二辛可宁酸形成紫色复合物，在562nm有最大吸收值。

需短时间10min内完成

✦Lowry法：

碱性条件蛋白质与铜形成复合物可复原磷钼酸－磷钨酸试剂，产生深蓝色。

特点：

灵敏，准确度高；

操作步骤多，繁琐；

影响因素多（盐酸胍、尿素、EDTA等）

✦考马斯亮蓝法：

灵敏，操作简单，重复性好；

抗干扰能力弱

✦SDS-凝胶染色与扫描分析法

2、蛋白质纯度的测定：

电泳（SDS-PAGE）、质谱法、色谱法、末端氨基酸分析法

3、蛋白质分子量的测定：

SDS-PAGE、凝胶色谱、质谱法

4、蛋白质等电点的测定

5、蛋白质序列分析

✦N末端氨基酸序列分析：

鉴定蛋白质的种类；

C末端分析：

判断表达、纯化过程中有无加工

6、蛋白质二硫键分析

7、蛋白质活性的测定

8、免疫测定法

9、内毒素分析、宿主蛋白和核酸残留分析

基因工程药物的实例：

干扰素（IFN）、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（CMCSF）、人白细胞介素-2（IL-2）、胰岛素、人生长激素（hGH）

第三章动物细胞工程制药

动物细胞的体外培养

★体外培养动物细胞的形态：

贴壁依赖性细胞，非贴壁依赖性细胞，兼性贴壁细胞

♦贴壁依赖性细胞：

成纤维样细胞型（主要来源于中胚层组织）；

上皮样细胞型（主要来源于外胚层和内胚层组织）

♦非贴壁依赖性细胞：

又叫悬浮细胞，一般呈圆球形。

主要来源于血液、淋巴组织、杂交瘤细胞

♦兼性贴壁细胞：

如CHO细胞、小鼠L929细胞

动物细胞的生理特点

1）细胞的分裂周期长，一般为12~48h（G1→S→G2→M）

2）细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象

3）正常二倍体细胞的生长寿命是有限的

4）动物细胞对周围环境十分敏感（如渗透压、pH、离子浓度、剪切力、微量元素等的变化耐受力很弱）

5）动物细胞对培养基的要求高（需要12种必需氨基酸、8种以上的维生素、多种无机盐和微量元素、作为主要碳源的葡萄糖，以与多种细胞生长因子和贴附因子，而且不同种类要求又有变化。

）

6）动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同

培养条件要求高、本钱贵，产量低；

多半是分泌在胞外的，收集纯化方便，得到了较完善的翻译后修饰

★动物细胞培养的条件

（一）环境条件：

直接接触的器材、防止污染（显著地污染标志：

pH值迅速改变，细胞外形模糊，甚至出现细胞集落）、水质、pH（大多是7.2-7.4）、渗透压、温度、通氧量、根本营养物质

（二）营养要求：

水、碳源、氮源、维生素、激素、无机盐等

♦碳源不能为无机物，大多只能利用葡萄糖

♦氮源不能为无机物，主要利用各种氨基酸

♦在多数情况下，需要添加5％－20％的小牛血清，或适量动物胚胎浸出液。

培养基：

天然培养基，合成培养基，无血清培养基

♦天然培养基：

主要见于早期阶段，来源：

血浆凝块、淋巴液、血清（最常用有效）、羊水、腹水等。

分维持液（低或不含牛血清）和生长液（5%-20%牛血清）

♦合成培养基：

主要成分：

糖、氨基酸、核苷酸前体、维生素、激素、缓冲体系、无机盐等

♦无血清培养基

①提高了细胞培养的可重复性，防止了由于血清批之间差异的影响；

②减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；

③供给充足、稳定；

④细胞产品容易纯化；

⑤防止了血清中某些因素对有些细胞的毒性；

⑥减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于实验结果的分析

血清的作用：

提供各种生长因子和激素，贴附因子和伸展因子，可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白，必须的脂肪酸和微量元素

★其他常用溶液：

平衡盐溶液；

培养基pH调整液；

细胞消化液（胰蛋白酶，EDTA）；

抗生素溶液

动物细胞培养的根本技术和方法★

★动物细胞培养的方法：

原代培养、传代培养、克隆培养

♦细胞的原代培养：

组织块培养法、单层细胞培养法。

取动物组织块→剪碎→分散处理（加胰蛋白酶或胶原蛋白和EDTA）→洗涤纯化→计数稀释→培养

♦细胞的传代培养：

离心或酶消化法收获细胞，计数后，以适当浓度接种到新的培养环境中

♦单克隆培养

动物细胞培养的根本技术：

细胞别离（离心法；

蛋白酶消化法）；

细胞计数；

细胞传代；

细胞的冻存（慢冻，液氮,－196度）和复苏（快融，投入37℃水浴融化）

♦冻存主要步骤：

活性好的细胞，加保护剂（DMSO等）混合；

做好标记（细胞种类、日期等）；

逐渐降低温度，最后放至液氮中；

降温梯度要适宜，总的原如此是慢冻

生产用动物细胞

原代细胞：

费钱费力，少用

传代细胞系：

安全，特点：

2n核型，贴壁依赖，接触抑制，有限传代（50代）

转化细胞系：

自发转化或人为转化，失去了正常细胞的特点，可=无限增殖传代，适宜大规模工业培养

工程细胞系：

融合细胞系（仙台病毒融合法、聚乙二醇融合法、电融合法）；

基因工程细胞系

♦病毒载体：

牛痘病毒。

腺病毒和逆转录病毒载体，杆状病毒载体-昆虫细胞系统

♦基因工程细胞主要的筛选系统，

①HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）选择系统，筛选tk+、hgprt+的转化细胞

②GPT（HAT、黄嘌呤、甘氨酸、霉酚酸）选择系统，筛选gpt+的转化细胞

③G418（Geneticin）选择系统，筛选Neor的转化细胞

④MTX选择系统，筛选dhfr+的转化细胞

细胞库的建立：

原始细胞库（MCR）→生产用细胞库（MWCR，又称工作细胞库，主细胞库→生产细胞库）

常用生产用动物细胞：

BHK-21，C127细胞，CHO-K1，COS细胞，MDCK细胞，WI-38，MRC-5，Namalwa，Sf-9，Vero，SP2/0-Ag14

动物细胞大规模培养

★动物细胞的大规模培养方法

•悬浮培养：

适用于非贴壁依赖细胞或兼性贴壁细胞

优点：

操作简便，培养条件均一，传质传氧较好，容易扩大培养，可以借鉴细菌培养的经验。

缺点：

细胞培养密度较低。

•微载体培养：

用于培养贴壁细胞。

充分发挥悬浮培养的一切优点。

理想的微载体应具备：

生物相容性、无毒性、外表惰性、比重适当（1.030~1.045g/ml）、粒径均一，在60~250μm之间（溶胀后）、光学透明、柔软、耐高压灭菌温度、反复屡次使用、制备简单、原料充分

•多孔载体培养：

可用于悬浮细胞与贴壁细胞。

细胞在网格内，能防止受到剪切力的损伤，因此培养体系可以提高搅拌速度和通气量。

多孔载体的一般条件：

具备生物相容性、机械稳定性和热稳定性

•微囊化培养：

防止剪切力对细胞造成的损伤；

获得较高细胞密度107－108个/ml；

利于纯化；

可采用多种生物反响器进展培养

•中空纤维培养：

把细胞接种在中空纤维的外腔，利用中空纤维模拟毛细血管提供营养。

理想的动物生物反响器必须具备的根本要求：

1体系中的各种材料，对细胞必须无毒性。

2生物反响器结构的传质、传热和混合性能好。

3密封性能良好，可防止一切外来微生物的污染。

4培养环境多种物化参数可自动检测和调节控制，控制的准确度高，且能保持环境质量的均一。

5可长期连续运转，尤其对于动物细胞而言。

6容器加工制造时要求内面光滑，无死角。

7拆装、连接和清洁方便，耐高压蒸汽消毒便于操作消毒。

8设备本钱尽可能低。

★动物细胞生物反响器

✦规模：

实验室规模：

<

20L；

中试规模：

20－100L；

生产规模：

>

100L

✦类型：

搅拌罐式；

气升式；

中空纤维式；

透析袋或膜式；

固定或流化床式；

一次性摇袋式细胞培养

✦主要操作方式：

♦分批式操作：

能够控制的参数只有PH、温度和通气量

♦补料-分批（或流加式）操作：

不断地向系统中补充新的营养成分

♦半连续式操作

♦连续式操作和灌流式操作：

后者取出局部条件培养基时，绝大局部细胞仍保存在反响器内，而连续式培养如此同时也取出了局部细胞。

转基因动物

根本原理与步骤：

外源目的基因的制备→外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞→选择获得携有目的基因的细胞→选择适宜的体外培养系统和宿主动物→转基因细胞胚胎发育与鉴定→筛选所得的转基因动物品系

转基因动物制作方法

✦经典的技术路线 

：

基因显微注射法，最常用、成功的方法，成功率低

✦整合胚胎移植的技术路线：

受精卵的成活率高达90％以上，外源基因整合率高，提高受孕率

✦核移植（克隆）的技术路线：

体细胞核移植；

核移植前导入目的基因。

✦整合卵受精的技术路线：

卵母细胞导入目的基因后再与精子受精。

✦具体方法：

基因显微注射法、反转录病毒感染法、胚胎干细胞方法，精子载体导入法、基因打靶法、人工酵母染色体法★

转基因动物研究出现的问题：

制作转基因动物效率低；

外源基因在宿主基因组中的行为难以控制；

转基因表达水平低

转基因动物反响器：

（bioreactor）目的片段在器官或组织中表达的转基因动物。

如乳腺、膀胱、血液等

动物细胞产品制造实例：

类淋巴细胞干扰素、组织型纤溶酶原激活剂、单链尿性纤溶酶原激活剂-尿激酶原、促红细胞生成素（EPO）、凝血因子VIII、乙型肝炎疫苗

第四章抗体工程制药

概述

抗体工程应用于医学领域：

研究，以免疫转印法检测特定抗原；

医疗，以毒素连结抗体攻击病变細胞；

检验，以ELISA侦测特定病原体；

多克隆抗体（polyclonalantibody，pAb）简称多抗。

如:

免疫血清（含多种特异性抗体）

实际意义：

预防、治疗感染性疾病，如：

破伤风抗毒素血清（抗破伤风）；

胎盘球蛋白（抗病毒感染）。

副作用：

→超敏反响。

临床诊断，如：

肥达氏反响（伤寒、副伤寒）。

特异性差

单克隆抗体（monoclonalantibody,mAb）简称单抗★

优势：

特异性高：

只识别某一个特定的抗原决定簇。

均一性好：

其H链、L链与V区独特性其完全一致，所得到的抗体结构和生物学性状完全一致。

杂交瘤细胞：

既能产生单一抗体，又能无限增殖

抗体分子的结构和功能★

根本结构:

四肽链结构

重链（H链）和轻链（L链）天然Ig分子中，重链同类，轻链同型。

重链可分为五类：

μ、γ、α、δ、ε链——IgM、IgG、IgA、IgD、IgE；

轻链可分为κ、λ型。

可变区（V区）、恒定区（C区）和铰链区（木瓜蛋白酶、胃蛋白酶）

♦VL、VH区各有3个超变区（也称互补决定区，CDR1-3），共同组成Ig的抗原识别部位，形成与抗原决定簇互补的表位。

可变区中的其它局部变化较小，称为骨架区（FR）

♦C区决定Ig分子的异种抗原性，主要发挥抗体分子的效应功能。

抗体分子的价位：

指抗体分子能结合的抗原表位数的多少。

VH和VL的CDR区共同构成抗原的结合位点，因此一个单体免疫球蛋白分子有两个抗原结合点，故习惯将单体抗体分子称为2价分子。

单克隆抗体的制备

产生杂交瘤细胞的三个关键点：

B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的特性、细胞融合技术、杂交瘤细胞的筛选

单克隆抗体制备的根本过程（理解）：

抗体与动物免疫，提取能够产生抗体的B淋巴细胞，B淋巴细胞与小鼠的骨髓瘤细胞在灭活的仙台病毒/聚乙二醇的诱导下融合，并在特定的选择培养基下筛选出杂交瘤细胞。

在体外条件下做大规模培养/注射到小鼠腹腔内增殖。

再提取出大量的单克隆抗体,最后进展纯化。

抗原和免疫：

抗原的制备（通常和佐剂混合，增强免疫应答）、免疫动物（体内/体外免疫方法；

动物的选择：

一般采用与骨髓瘤供体细胞同一品系的动物）

细胞的融合和杂交瘤细胞的筛选

细胞的融合：

制备脾细胞悬液：

最后一次免疫后三天，1×

108个；

制备骨髓瘤细胞悬液：

对数生长期细胞，（2～3）×

107个；

融合：

40－50％PEG（MW4000），37℃，5min

★HAT培养基筛选杂交瘤细胞

HAT培养基筛选原理：

H（次黄嘌呤）；

A（氨基蝶呤）；

T（胸腺嘧啶）。

骨髓瘤细胞不具备HGPRT和TK，B淋巴细胞寿命短。

影响细胞DNA的合成：

H促进了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）途径；

T促进了胸腺嘧啶激酶（TK）途径；

内源性途径（谷氨酰胺、鸟核苷酸单磷酸，二氢叶酸复原酶途径）被A（叶酸的拮抗物）阻断

步骤：

融合后细胞→HAT培养基→HT培养基→正常培养基

杂交瘤细胞的检测和克隆

抗体的检测：

仅少数杂交瘤细胞可以分泌预期抗体。

酶联免疫吸附法（ELISA）、间接免疫荧光法、放射免疫测定法、流式细胞仪法

杂交瘤细胞的克隆：

有限