感受态细胞制作Word格式.docx

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感受态细胞制作Word格式.docx

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感受态细胞制作Word格式.docx

7、4℃,4000rpm(2500g),10min集菌(用新的50ml进口离心管)。

8、超静台内弃上清,将管倒扣在事先灭好的吸水纸上,大力向下击打,尽可能去掉剩余SOB(LB)。

9、每管倒入10ml预冷的Inoue转化缓冲液,拧紧盖子。

在冰上来回滑动重悬细菌(重悬的时间与向下击打的力度和来回滑动的速度相关,这两者与感受态效率没有直接关系)。

10、超静台内向每管倒入约30ml预冷的Inoue转化缓冲液,来回颠倒混匀,冰上10min。

11、4℃,4000rpm,10min集菌。

12、超静台内弃上清,将管倒扣在事先灭好的吸水纸上(换一张吧,别用刚才那张),大力向下击打,尽可能去掉剩余缓冲液。

13、每管倒入10ml预冷的Inoue转化缓冲液,拧紧盖子。

在冰上来回滑动重悬细菌。

14、轻轻来回混匀(记住要轻轻)。

置于冰上10min。

15、将冰浴的感受态细胞分装到事先灭菌后并放到-20或4℃的EP管中,一个一个丢到液氮罐里,然后冻到-80(建议100μl每管,传说液氮速冻可以提高5倍的感受态效率)。

感受态效率在108-107不等。

Inoue法制备大肠杆菌超级感受态细胞

关键词:

 

Inoue法 

大肠杆菌 

感受态2008-07-2100:

00 

来源:

互联网 

点击次数:

1515

实验步骤:

1、InoculatefromanovernightgrowninLB.从培养过夜的LB平板上挑取单菌落。

2、Growin250ml"

SOB"

at18℃untilOD600 

=0.6.(0.3)接种于250mlSOB,18度培养至OD=0.6。

3、Onicefor10minutes.菌液置冰上10分钟。

4、Spinat2500xg(5000rpminaSorvallGSAor3000rpminaBeckmanJ-6Bcentrifuge)for10min.at4℃.4度2500g离心10分钟。

5、Resuspendcellsgentlyin80mloficecold"

TB"

.小心用80ml预冷TB重悬细胞。

6、Onicefor10minutes.(30min)菌液置冰上10分钟。

7、Spinat2500xg(5000rpminaSorvallGSA,5500rpminaSorvallSS-34,or3000rpminaBeckmanJ-6Bcentrifuge)for10min.at4℃.4度2500g离心10分钟。

8、Resuspendcellsgentlyin20mloficecold"

.小心用20ml预冷TB重悬细胞。

9、AddDMSOtoafinalconcentrationof7%.加入DMSO至终浓度7%。

10、Placeonicefor10minutes.置冰上10分钟。

11、Aliquotinto1-2mlandfreezeinliquidnitrogen.分装,液氮速冻。

12、Storeinliquidnitrogenor-80oC.冻存。

SOBMediumandTB(TransformationBuffer)

SOB 

2%(w/v)bactotryptone 

TB 

0.5%(w/v)yeastextract 

10mM 

Pipes 

NaCl 

55mM 

MnCl2 

2.5mM 

KCl 

15mM 

CaCl2 

MgCl2 

250mM 

MgSO4 

在加入MnCl2之前先用5NKOH调pH值到6.7,adjustpHto6.7with5NKOHpriortoaddingtheMnCl2 

thankstoMarkusSchneemannforthetip

pH6.7-7.0 

Note:

Competentcellsarefragile(cellwallisthoughttobeweakened),thereforetreatthecellsgentlywhenpreparingthesecells.Donotvortexorpippetteupanddowntoresuspendthecells.Donotspinthecellsattoogreataspeed(spinningdownat5000gwillcausesomecellstolyse).

Alwayskeepthecellschilledwhenmakingcompetentcell.Donotletthemwarmup.

Freezingthecellsappeartomakecellsmorecompetent.

Somecellstrainsmayworkbetterthanothers(DH5alphaworkswellinmyhand).Notealsothatsomecells(e.g.HB101)hasgreaterrecombinationactivitythanothers.

Thismethoddoesn'

tappeartoworkwithBL21,sojustgrowthecellsat30or37℃whenmakingBL21competentcells.However,ithasbeensuggestedthattheefficiencyofBL21preparedusingInouemethodmaybeimprovedbytreatingitwithDTTbeforefreezing(addto3.5%v/vofa2.2MDTT,10mMKAcpH6solutionandincubate10minutesonice).

Heatshocktimeshouldbedeterminedfordifferentstrainsofcell.ForDH5alphaorJM109use30-45sec.ForBL21use120sec.

Deactivateligasepriortotransformation.Ligasemayreducetransformationefficiency.

Dilutingtheligationmixture(~5x)canalsoincreasetransformationefficiecybyreducingtheamountofreagents/contaminantsthatmayaffecttransformation.Likewiseithasbeensuggestedthatphenol/chloroformtreatmentmayalsoincreaseefficiency,butitisprobablytoomuchtroubletobothertrying.

TheDNAaddedshouldnotbemorethen5%ofthevolumeofcompetentcellsused.ThefinalDNAconcentrationshouldnotexceed5ng/μl.

Themethodaboveshouldgiveatransformationefficiencyofmorethan108cfuperμgofplasmidDNA(pUCorpBluescripts)withover109cfupossible.

Transformationefficiencyhasaroughlyinverserelationshipwiththesizeofplasmids.CellswithdeoRmutaion(e.g.DH5alpha)canimprovedthetransformationoflargeplasmid.Relaxedplasmidshas~3/4ofthetransformationefficiencyofsupercoiledplasmid.

2differentplasmidscanbetransformedatthesametime,oroneafteranother.Buttheymustbecompatible(theycannothavethesamereplicon).

Forroutinetransformationwherebyefficiencyoftransformationisofnoimport,someofthestepsmaybeshortenoromitted.Forexample,heat-shockstepmaybeunnecessaryandrecoveryincubationtimeat37℃canbereducedoromitted(butdonotethatthismaydependsontheantibioticusedforselection- 

forampicillin-typeantibioticstheincubationtimeisnotreallythatimportant,thereforeyoucanplatethecellsstraightafterheat-shockifyouwish.forotherantibiotics,however,theincubationtimemaybeessential).

Platingcells- 

dry1.5%agarplates(exposedupsidedown)at37℃for2-4hoursjustbeforeuse,theplateshouldbeabletosoakupto0.8-1mlofmediawhenplating.Forblue-whiteselection,itisnotnecessarytomakeX-galplate,justaddX-gal+ 

IPTGdirecttocells,mixandthenplate.

Detergentsmaybedetrimentaltothetransformabilityofthecompetentcells,thereforetheglasswareusedformakingcompetentcellsshouldnotbewashedwithdetergents.Polycarbonateflaskmayalsobeusedinsteadofglassflask.DMSOcandissolvepolystyrene,thereforeusepolypropylenetubes.

Whencloningdifficultandlessstablesequence(e.gpalindrome,repeats,LTRsequences),ithelpstogrowtransformcellsatlowertemperatures(25-30℃orroomtemperature)inveryrichmedia(e.g.TerrificBroth).Alsoterminategrowthbeforereachinglatestationarygrowthphasewhengrowninliquidmedia(i.eharvestcellsatOD550 

between1and2).Useofstabilizingstrainisalsouseful.

Thereareothermethodsofmakingcompetentcells- 

e.g.CaCl2 

method,RbClmethodwhichismoreeffectivethanCaCl2 

method.Electroporationissupposedtogivehigherefficiency(upto1010transformantsperμgplasmidclaimed),butforthesimplecloningthatwedo,itsuseisnotwarranted(andit'

smoreexpensive,moretroublethanit'

sworth,etc.).

Ifacoolingshakerisnotavailable- 

growthecellsatroomtemperature.MorediscussionsonmakingcompetentcellaswellasreferencescanbefoundinTIBSarticles"

Preparingμltra-competentE.coli"

and"

Bettercompetentcells"

Itisalsopossibletotransformcellsstraightfromplate.Itisconvenientbutyoushouldexpectlowefficiency.Seethefollowingreferenceformoredetails(aswellasmoreinformationoncompetentcellsandotherprotocols):

本文引自:

Hanahanetal,MethodsinEnzymology204,63

大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法

感受态细胞(Competentcells):

常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA,所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。

受体细胞经过一些特殊方法(如:

CaCl,RuCl等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competentcell)。

转化:

是将异源DNA分子引入一细胞株系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段,是基因工程等研究领域的基本实验技术。

进入细胞的DNA分子通过复制表达,才能实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。

转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。

α-互补现象:

因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息,编码α-互补肽,该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补(α-互补)。

当这种载体转入可编码?

-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时,在异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下,宿主可同时合成这两种肽段,虽然它们各自都没有酶活性,但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。

所以称这种现象为α-互补现象。

由互补产生的α-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落,所以利用这个特点,在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点,当插入一个外源DNA片段时,会造成LacZ(α)基因的失活,破坏α-互补作用,就不能产生具有活性的酶。

所以,有重组质粒的菌落为白色,而没有重组质粒的菌落为蓝色。

方法一:

TSS方法制备感受态细菌(又称一步法)

一、准备工作

1、缓冲液1×

TSS的配制

事先配制1M的氯化镁:

20.3g氯化镁(6分子水结晶),定容于100ml去离子水后封装,不用灭菌。

取干净的100ml量筒和100ml烧杯,用量筒量取100ml去离子水,加入至烧杯中,取1g蛋白胨,0.5g酵母抽提物,0.5g氯化钠,10gPEG(MW=3350),5mlDMSO,5ml的1M氯化镁,溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5,混匀后用0.22um滤器过滤除菌。

储存在4度,保质期约6个月。

2、已划平板(或者用枪头沾取并稀释后涂布)并在培养箱中过夜培养的菌种—Dh5α,用于接种并振荡培养。

两个锥形瓶,分别装有30ml和50mlLB,灭菌后置于4℃冰箱备用。

3、若干已灭菌的琼脂平板,一个未加抗生素,用于第二步的接种,其余做转化用。

二、感受态制备程序

前一天晚上调单菌落至30mlLB中过夜培养(12-16h),按1:

100比例将过夜培养的菌液(500ul)加入到新鲜的50mlLB培养液中,于37℃振荡培养至OD600约为0.4(培养时间2h40~50min)。

冰浴30分钟后4度1000g离心10min,弃上清,收获细菌。

加入原体积十分之一(这里为5ml)的1×

TSS液(冰预冷)悬浮细胞,然后分装成100μl/份,全部冰上操作,-80℃保存。

三、转化

取一管(100μl)感受态细菌,(冻存细胞应置于冰上缓慢融化后立即使用)加入3-5μlDNA(0.1~100ng),轻轻混匀后冰浴30min。

加入0.9ml含20mmol/L葡萄糖的LB培养液,37度150r/min温和振荡培养60min,涂布,室温放置约20分钟后放于37度恒温培养箱过夜培养(17-20h)。

方法二:

CaCl2法

细菌转化的方法多以Mendel和Higa(1970)的发现为基础,其基本方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌,使之进入感受态得以转化。

  用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞,常用于成批制备感受态细菌。

本法适用于大多数大肠杆菌菌株,且迅速、重复性好。

  1.从37℃培养16~20h的新鲜平板中挑取一个单菌落(如大肠杆菌DH5α),或1ml新鲜的16~20h过夜培养物,转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中。

于37℃剧烈振摇培养约2~3h(旋转摇床200~300r/min),每隔20~30min测量OD600值≈0.4。

  2.在无菌条件下将细菌转移到一个,用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中,在冰上放置10~20min。

  3.于4℃用SorvallGS2转头(或与其离心管相配的转头)以4000r/min离心10min,以回收细胞。

  4.倒数培养液,将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。

  5.以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀,放于冰上10min。

  6.于4℃用SorvallGS3转头(或与其相应的转头)以4000r/min离心10min,以回收细胞。

  7.倒出培养液,将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。

  8.每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1MCaCl2重悬每份沉定,此时,可以迅速将细胞分装成小份,液氮中冰冻,-70℃贮存备用。

  9.用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中,每管加DNA或连接反应混合物(体积≤10μl,DNA≤50ng),轻轻旋转以混匀内容物,在冰中放置30min。

  10.将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上,放置90s~2min,不要摇动试管。

  11.快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却1~2min。

  12.每离心管加800μlSOC培养基,用水浴将培养基加温到37℃,然后将管转移到37℃摇床上,温育45min使细菌复苏,并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。

  13.将适当体积(每个90mm平板可达200μl)已转化的感受态细胞转移到含200mmol/lMgSO4和相应抗生素的SOB培养基上。

  14.将平板置于室温至液体被吸收。

  15.倒置平皿,于37℃培养,12~16h后可出现菌落。

方法三:

CASsuperOne-StepCompetentCellPrepsKit

采用一种简单便捷的方法处理大肠杆菌,使其成为感受态细胞,便于质粒DNA的转化,可满足一般实验的要求。

与CaCl2法相比具有多种优点:

使用方便,只需一步即可完成感受态细胞的制备;

转化效率略高于CaCl2法,一般可达106-108cfu/μg,满足一般实验需要;

感受态细胞制成后即可保存于-70℃,无须加入甘油,并且经长期保存活力无明显下降。

1.从液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌冻存菌,在LB平板上划线,37℃过夜至长出单菌落。

挑形态饱满的单菌落2个,分别接种5mlLB培养基中,37℃,250rpm,过夜培养。

2.次日从5mlLB培养物吸取200μl转入50mlLB培养基中(250ml锥形瓶),37℃,250rpm培养2小时,此时OD600约0.4—0.5。

二、感受态细胞的制备

3.吸取1ml菌液到1.5ml离心管里,5000rpm离心5分钟,弃去上清。

4.加入100μl预冷的SolutionA,悬浮菌体,冰浴30分钟。

5.此时感受态细胞已经制成可立即使用或-70℃保存。

三、细胞转化

6.在感受态细胞中加入100pg-1

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