第五章种子生活力和活力测定Word格式.docx
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（1）测定深度休眠种子；
收获后需马上播种的种子；
发芽缓慢的种子；
要求估测发芽潜力的种子。
另外，也适用于：
⑵测定发芽末期未发芽种子的生活力，特别是怀疑有休眠时。
（3）测定种子收获或加工过程中的种子损伤的原因（如热害、机械损
伤、虫蛀等）。
（4）解决发芽试验中存在的问题，如查明不正常幼苗产生的原因；
怀疑杀菌剂、种子包衣的处理效果等。
（二）、四唑测定法的原理
有生活力的种子活细胞内有脱氢酶，可与氧化还原反应指示剂:
四唑（无色）反应而显色，被还原成为红色、稳定的三苯基甲腊
（triphenylformazam）。
可根据四唑染成的颜色和部位，区分种子红色
的有生活力部分和无色的死亡部分。
NfC.HC）
除了完全染色的有生活力种子和完全不染色的无生活力种子外，还可能出现一些部分染色的种子。
说明在不同部位存在面积大小不同的坏死组织。
判断种子有无生活力，主要看胚和胚乳不染色坏死组织的部位及面积大小，而不完全取决于染色的深浅。
染色的深浅可以区别健壮程度。
即染色愈深，种子生活力愈旺盛。
四唑染色是一酶促反应，反应不仅受酶活性的影响，还受底物浓度、反应温度、pH等因素的影响。
（三）、四唑测定法应用的化学试剂
1、四唑四唑盐类有多种，常用的是2，3，5—氯化三苯基四氮唑，
{英文2,3,5—triphenyltetrazoliumchloride},缩写为TTG
（1）特性
①白色或淡黄色粉剂,易溶于水,有微毒,使用时不要接触（少接触）。
②见光易被还原成粉红色，需用棕色瓶包装，再裹一层黑纸。
同样，配好的四唑溶液也应装入棕色瓶里,暗处保存,种子染色也需在暗处和弱光处进行。
（2）四唑液浓度
常用的四唑染色浓度为0.1%〜1.0%（m/v）.—般来说：
切开种胚的种子可用0.1%〜0.5%的四唑溶液；
整个胚、整粒种子需用1.0%的四唑溶液。
（3）pH：
四唑溶液的pH要求在6.5〜7.5，若溶液的pH不在此范围，反应不能正常进行。
因此,对于游离酸含量高的四唑应当用缓冲液配制。
即一般国产的四唑游离酸含量高,要用缓冲液配制（进口的可直接用蒸馏水配制）。
配制方法：
称取lg（或0.1g）四唑粉剂溶解于100mL磷酸缓冲液中，即配成1.0%（或0.1%）的四唑溶液；
当用酸度计测定时，若四唑液的pH值达不到要求，则可用稀NaOH或NaHCO3溶液加以调节。
配好的四唑溶液应保存在棕色瓶里，一般有效期可保持数个月。
若存放在冰箱里，有效期更长。
2、磷酸缓冲液：
其配方如下：
（1）ISTA及GB规程法：
首先配两种溶液，然后按比例混合即成。
溶液I:
称取9.078gKH2PO4（磷酸二氢钾）溶解于1000ml蒸馏水中；
溶液称取9.472gNa2HPO4（磷酸氢二钠）
或11.876gNa2HPO4.2H2O溶解于1000mL蒸馏水之中。
然后取溶液1:
2份和溶液3份混合即成。
以上比较麻烦，也可用北美官方种子检验规程:
（2）AOSA规程法：
在1000mL蒸馏水中加入5.450gNafPOq和3.790gNa2HPO4充分溶解即成。
3、乳酸苯酚透明液:
用于染色后的小粒豆类和牧草种子，经四唑染色后使种皮、稃壳或胚乳变得透明，以便透过这些部分清楚地观察其胚的染色情况。
配法:
20mL乳酸＋20mL苯酚（若苯酚是结晶形式，则需溶化为液体）＋40mL甘油＋20mL蒸馏水混合而成。
该药液有毒性，在使用时防止触及皮肤或衣服等。
配制时最好戴塑胶薄膜手套，并在通风橱里操作。
（四）、四唑测定法的程序参照96版《国际种子检验规程》及95GB:
1、试验样品:
随机数取净种子100粒，2〜4次重复（GB2〜4次重复，
ISTA4次重复）
2、种子预处理（预措预湿）
（1）目的：
大部分种子在测定前都需经过预处理。
目的：
使种子加快和充分吸湿，软化种皮，方便样品准备，促进酶的活化，以提高染色的均匀度、鉴定的可靠性和正确性。
因为种子吸湿后，切开、针挑种皮或切开营养组织变得容易，而干种子则工作困难，并且活细胞内的酶尚未活化，染色效果不良。
因此，预措预湿对正确测定是很重要的。
（2）预措：
指在种子预湿前除去种子外部的附属物。
包括剥去果壳和在种子非要害部位弄破种皮。
如水稻种子需脱去稃壳；
花生剥去果壳；
豆科硬实种子需刺破种皮等。
注意：
预措不能损伤种子内部胚的主要构造。
而大多数种子则不需预措处理。
（3）预湿：
是四唑染色测定的必要步骤。
因为吸账种子一般比干种子不易破碎，比较容易切开或刺破种皮。
目前常用预湿方法有二种：
1缓慢吸湿：
将种子放在纸上或纸间吸湿。
适用于：
直接浸在水中容易破裂的种子；
已经劣变的种子（陈种子）；
过分干燥的种子。
缓慢吸湿，能较好地解决吸湿和供氧的矛盾。
GB规定：
像大豆、菜豆、葱、花生等种子要求缓慢纸床预湿。
禾谷类种子既可水浸预湿，也可缓慢纸床预湿。
缓慢预湿可采用下面两种方法：
a纸床上预湿：
小粒豆类种子，如苜蓿、三叶草等种子。
b纸卷或纸间预湿：
像大豆、菜豆、豌豆等种子。
2快速水浸预湿：
将种子完全浸入水中，充分吸胀。
因为种子直接浸入水中，吸水快、吸水均匀，可缩短预湿时间。
适用于种子直接浸入水中，不会造成组织破裂的种子。
包括水稻、麦类、玉米等。
浸种温度一般采用20C〜30C水温。
具体种类和浸种时间见《农作物种子四唑染色技术规定》。
3、染色前的种子处理
种子在染色前需将胚的主要构造和活的营养组织暴露出来，利于四唑溶液渗透，便于正确鉴定。
（p63图5－1）表明种子不同切法的部位，常见的有以下几种：
（1）不须样品准备：
a种皮渗水性良好的小粒豆类种子（如紫花苜蓿和小扁豆等），染色时就能随着四唑溶液的渗入而吸胀，并在染色后剥去种皮就可正确鉴定。
这类种子不须样品准备。
b、大粒豆类：
可采用缓慢吸湿后不须样品准备。
（如菜豆和大豆等）
但在染色后观察鉴定前也需剥去种皮，以便鉴定更为可靠。
（2）沿胚纵切取半粒：
适用于具有直立胚的大粒禾本科种子。
如玉米、麦类和水稻等种子。
方法：
沿胚纵切，使胚的主要构造暴露出来，取其一半用于染色观察。
（3）剥去种皮：
棉花、十字花科种子需剥去种皮或内膜；
瓜类也剥去种皮。
方法是：
将预湿后的整个种皮剥去。
4、四唑染色
将处理好的种子放在小烧杯内，然后加入适宜浓度的四唑溶液，以淹没种子为度，移至一定温度的黑暗恒温箱内进行染色反应。
染色时间：
因种子种类、样品准备方法、生活力的强弱、四唑溶
液浓度、pH值和温度等因素的不同而有差异，其中温度影响最大。
在20〜45C范围内，温度每增加5C,其染色时间可减少一半。
例如：
30C适宜染色时间为6h,
35C则只需染色反应3h,
40C下仅需1.5h。
一般选择35C
35C染色：
玉米、麦类等禾谷类种子0.5〜1h
豆类种子3〜4h
剥去种皮染色的种子2〜3h
具体见《农作物种子四唑染色技术》。
达到规定时间或染色已很明显时，倒去四唑液，用水冲洗。
如果到达规定时间种子染色仍不够完全，可适当延长染色时间。
5、鉴定前处理书上复杂
不进行处理的种子，观察前要适当处理使胚部暴露出来，具体处理方法规程中都有：
（读本p201-204）如一些小粒豆类、棉籽沿胚中轴纵切；
瓜类除去种皮和内膜；
大粒豆类（大豆、菜豆、花生）：
除去种皮，掰开子叶，露出胚芽大粒种子可直接用肉眼或放大镜观察；
小粒种子最好用10〜100倍体视镜观察。
6、观察鉴定测定结果的可靠性取决于检验人员对染色组织和部位的正确识别、工作经验等综合运用能力。
观察鉴定的主要目的是区别有生活力和无生活力种子。
（1）一般鉴定原则：
a、凡是胚的主要构造染成鲜红色，为有生活力种子。
b、凡是胚的主要构造局部不染色，不染色部分超过允许范围，为不正常种子。
c、凡是完全不染色的为死种子。
不正常种子和死种子均作为无生活力种子。
（2）观察的部位：
1禾谷类：
主要观察胚芽、胚轴、胚根、盾片。
鉴别标准：
除完全染色的为有生活力种子外，下列有残缺的种子也有生活力:
a盾片上部或下部任一端不染色的部分v1/3
b、胚根的顶端：
玉米1/3不染色；
水稻、高粱2/3不染色；
麦类大部分不染色，但不定根的原始体须染色。
胚孚J果多^与种皮
X"
胚芽鞘
1—胚芽
「！
胚轴
舌Pr——胚根
（黑）艮鞘
理解：
胚芽必须染色，胚根不染色可以长出次生根。
2豆类：
有生活力的种子允许不染色的最大面积：
a、胚根顶端不染色：
花生为1/3;
蚕豆为2/3;
其他为1/2.
b、子叶顶端不染色：
花生为1/4;
蚕豆为1/3;
c、胚芽顶端不染色1/4，蚕豆除外。
3瓜类：
胚根顶端不染色允许1/2;
子叶顶端不染色允许1/2。
（胚芽必须染色）
4其他种属：
（棉属、芸苔属等）
胚根顶端1/3不染色；
子叶顶端1/3不染色。
P70图5-2小麦种子四唑测定结果的鉴定标准（单子叶）：
图中黑色部分表示染成红色，有生活力组织，白色部分表示不染色的死组织
1-6有发芽力：
1•整个胚染成鲜红色；
2〜5.盾片末端不染色；
6.胚根尖端不染色；
7-16无发芽力:
•胚芽不染色；
（一点也不行）
•胚轴不染色；
•胚的上半部不染色；
•盾片、胚根和胚根鞘不染色;
.整个胚不染色。
7•胚根3/4以上不染色8
9•盾片中部和盾片节不染色；
10
11•盾片末端和胚芽尖端不染色；
12
13•盾片不染色；
14
15•染成模糊的淡红色；
16
•・•••••・d・»
e
456
图5-E小査种子四哇测定结果的啓走标准
Idl・aV.
图手製色部分袤示染咸红芭.有吃SS力粗织.
白色酩介茨示不聲色的堆畑帜
L音览护力牛胚聲成解虹色2-5.有览芽力，15片末城未J&
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氐冇览芽力，4£
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券色g.无翁芽力"
师芽未誕色轧无溟寿力*於片中部和黛片节去卑
耳1仏；
C发丼力'
胚轴:
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駆色忆.无訪芽力•胖的上邛部未染色1乱无產芽力，尚片未染也
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饭上也IS.X发芽」扎赠牛駆*奂色
IS5-i丈豆种子匹腔测定结果的整毘标准
｛引自SsnrnclH.G.,1974）
L有爰并力”环全部樂庶懺红国2一有黨芽力+仅子叶星离蘇芽澤井少岳来卑芭証有发芽力.但于叶T超看21竦少昨未渠邑4.无左奇力.子叶上辭亜聲弗分耒卑鱼衣无发芽力*胚辐主辱部位未爆色氐无S：
蘇力,子叶一平収上耒筮色“或破刼・成胚堪和Iff芽巳死亡零
图5-3大豆种子四唑测定结果的鉴定结果标准
1-3有发芽力：
1.胚染成鲜红色；
2.仅子叶远离胚芽部分少量未染色；
3.仅子叶下部和边缘少许不染色；
4—6无发芽力：
4.子叶上部重要部位未染色；
（面积少也不行）
5.胚根主要部位不染色；
6.子叶一半以上未染色。
表1农作物种子四唑染色技术规定
种名
预湿方式及
时间h
染色前的准备
浓
度
%
35C
染色时
间，h
鉴定前的
处理
有生活力种子允许不染色、较弱
或坏死的最大面积
备注
小麦大麦黑麦
纸间或水中
30°
恒温
水浸种
3-4h，或纸间12h
a.纵切胚和四分之三胚乳。
b.分离带盾片的胚
0.1
0.5
1
a.观察切面
b.观察胚和盾片
a.盾片上下任一端三分之一不染色。
b.胚根大部分不染色，但不定根原始体必须染色
盾片中央有不染色组织，表明受到热损伤
玉米
同上
纵切胚和大部分胚乳。
观察切面
胚根；
盾片上下壬一端三分之一不染色
高粱
纵切胚和大部分胚乳
a.胚根顶端三分之二不染色。
b.盾片上下任一端三分之一不染色
水稻
纵切胚和四分之三胚乳
胚根顶端三分之二不染色
必要时可除去内外稃
棉花
纸间
a.纵切二分之一种子。
b.切去部分种皮。
C.去掉胚乳遣迹
2-3
纵切
a.胚根顶端三分之一不染色。
b.子叶表面有小范围的坏死或子叶顶端三分之一不染色
有硬实应划破种皮
菜豆豌豆绿豆花生大豆豇豆扁豆蚕豆
纸间6-8
无须准备
1.0
3-4
切开或除去种皮，掰开子叶，露岀胚芽
a.胚根顶端不染色，花生为三分之一，蚕豆为三分之二，其他种为二分之一。
b.子叶顶端不染色，花生为四分之一，蚕豆为三分之一，其他为二分之一
C.除蚕豆外，胚芽顶部不染色四分之一
南瓜丝瓜黄瓜西瓜冬瓜苦瓜甜瓜
纸间或水中在20-30°
C
水中浸6-8h
或纸间24h
b.剥去种皮。
C.西瓜用干燥布或纸揩擦，除去表面粘液
2-3h
，但甜瓜
1-2h
除去种皮和内膜
a.胚根顶端不染色二分之一。
b.子叶顶端不染色二分之一。
白菜型油菜不结球白菜结球白菜甘蓝型油菜甘蓝花椰菜萝卜芥菜
30°
C温水中浸种3-4h或纸间5-6h
a.剥去种皮。
2-4
a.纵切种子使胚中轴露岀。
b.切去部分种皮使胚中轴露岀
b.子叶顶端有部分坏死。
葱属
（洋葱、韭菜、葱、韭葱、细香葱）
纸间12
a.沿扁平面纵切，但不完全切开，基部相连。
b.切去子叶两端，但不损伤胚根及子叶。
0.2
1.5
a.扯开切口，露岀胚。
b.切去一薄层胚乳，使胚露岀
a.种胚和胚乳完全染色。
b.不与胚相连的胚乳有少量不染色
辣椒甜椒茄子番茄
纸间水中在
20-30°
C水中3-4h，或纸间12h
a.在种子中心刺破种皮和胚乳。
b.切去种子末端，包括一小部分子叶
a.撕开胚乳，使胚露岀。
b.纵切种子使胚露岀
胚和胚乳全部染色
芫荽芹菜胡萝卜茴香
水中
在20-30°
水中3h
a.纵切种子一半，并撕开胚乳，使胚露岀。
b.切去种子末端四分之一或三分之一
0.1-0.
5
6-24
a.进一步撕开切口，使胚露岀。
b.纵切种子露出胚和胚乳
苜蓿属草木樨属紫云英
水中22
0.5-1.
除去种皮
使胚露岀
b.子叶顶端三分之一，如在表面可二分之一不染色。
萬苣
茼蒿
水中在
C水中浸2-4h
a.纵切种子上半部（非胚根端）。
b.切去种子末端包括一部分子叶
a.切去种皮子叶使胚露出。
b.切开种子末端轻轻挤压，使胚露出。
b.子叶顶端二分之一表面不染色，或三分之一弥漫性不染色
向日葵
水中3-4
纵切种子上半部或除去果壳
除去果壳
b.子叶顶端表面二分之一不染色。
甜菜
水中18
a.除去盖着种胚的帽状物。
b.沿胚与胚乳之界线切开
24
48
扯开切口使胚露岀
b.子叶顶端三分之一不染色。
菠菜
a.在胚与胚乳之边界刺破种皮。
b.在胚根与子叶之间横切。
a.纵切种子，使胚露岀。
b.掰开切口，使胚露岀。
7、结果计算与处理
根据样品胚部的显色情况，分别计算各重复有生活力种子的百分率。
GB/T3543.7-1995对试验样品的规定至少200粒：
即2〜4次重复。
查重复间的最大允许差距：
XiX2X3X4—求平均数X
（GB:
但生活力有二、三次重复值；
而发芽试验无二、三次重复值）
X最大-X最小与容许差距比较：
〉容许差距重作；
＜容许差距结果正确用x表示。
【例】测某种子生活力，三次重复95%、96%、98%。
X=96.3%;
98-95=3V容许差距7。
若测二次重复：
95%、99%。
X=97%99-95=4＜容许差距6。
表2生活力测定重复间的最大容许差距GB/T3543.7-1995
平均生活力百分率%
重复间容许的最大差距
2
4次重复
3次重复
2次重复
99
-
98
3
6
97
4
7
96
8
95
9
93-94
7-8
10
91-92
9-10
11
90
89
88
13
87
14
84-86
15-17
81-83
18-20
15
78-80
21-23
16
76-77
24-25
17
73-75
26-28
71-72
29-30
18
69-70
31-32
67-68
33-34
64-66
35-37
19
56-63
38-45
55
46
20
51-54
47-50
（五）注意事项：
纵切禾谷类种胚时，一定要沿胚中部纵切，使切面显示胚的各
部分构造，否则会出现鉴定误差
1、若切面不正
若保留大的：
胚芽是完整的，染色时间短，胚芽可能不染色。
其他地方染色均匀，也属正常有生活力的种子。
若保留小的：
胚芽与盾片有缝，只要其他部分染色深、均匀，也有生活力。
2、切面粗糙：
切时剥开，部分细胞被撕开，细胞被破坏，表层细胞不染色。
所以切面要光滑。
这时染成乳白色与不染色是有区别的。
（p71离体胚培养法:
主要测定发芽缓慢或休眠期长的种子生活力，主要用于林木种子，农作物种子用的少。
）
四、染料染色法（GB中无，了解）同p73
（一）测定原理（TTC法：
活细胞染成红色；
本法相反：
活细胞不染色）
有生活力的种子，其活细胞原生质膜具有选择透性，当种子浸入染料后，染料大分子不能进入活细胞内，其胚部活组织不能被染料染色；
而死的种胚原生质膜丧失选择吸收能力，故可被染料染色。
（二）测定方法
1、靛蓝染色法
适用于豆类、谷类、棉花、瓜类和林木等大粒种子的生活力测定。
试剂为靛蓝：
蓝色粉剂，能缓慢溶于水。
测定方法如下：
（1）种子预处理：
（100粒X2次）
先将种子去壳，浸入30C水中，充分吸账。
浸种时间：
小麦、大麦、大豆、豌豆和向日葵等为3h，燕麦、芝麻等4h；
油菜、花生、棉籽等6h，
蓖麻、红麻、大麻等7h;
黍8h;
水稻12h;
玉米20h。
然后，禾
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