甘草总黄酮与石见穿总酚酸联用促肝星状细胞凋亡作用研究.docx

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甘草总黄酮与石见穿总酚酸联用促肝星状细胞凋亡作用研究

甘草总黄酮与石见穿总酚酸联用促肝星状细胞凋亡作用研究

（作者:

___________单位:

___________邮编:

___________）

【摘要】目的研究甘草总黄酮与石见穿总酚酸联用对氧化应激的肝星状细胞（HSC）的促凋亡作用。

方法MTT法检测甘草总黄酮与石见穿总酚酸联用对大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）增殖的影响。

次氮基三乙酸铁与HSC-T6体外共培养建立氧化应激模型,采用TBA法检测细胞内丙二醛（MDA）含量,运用邻苯酸酚自氧化速率法检测超氧化物歧化酶（SOD）活性。

荧光探针DCFH-DA检测细胞内活性氧水平。

荧光染料Hoechst33258观察细胞的形态及凋亡情况。

JC-1检测细胞内线粒体膜电位变化情况。

结果甘草总黄酮与石见穿总酚酸联合处理HSC-T6后,细胞的增殖受到抑制,并促进HSC-T6凋亡;细胞内线粒体膜电位下降;随着药物剂量的增加细胞内活性氧含量下降。

结论甘草总黄酮与石见穿总酚酸联用促进氧化应激的HSC凋亡,此作用可能与线粒体凋亡途径有关。

【关键词】甘草总黄酮;石见穿总酚酸;肝星状细胞;凋亡;线粒体膜电位

　Abstract：

ObjectiveToinvestigatetheeffectofGlycyrrhizauralensisflavonoidsandsalvianolicacid（GS）ontheapoptosisofHSC-T6cells.MethodsHSC-T6wereincubatedwithferricnitrilotriaceticacid（Fe-NTA）,SODactivityandMDAcontentinHSC-T6weredetected.MTTcolorimetricmethodandtrypanbluestainingwereusedtomeasurethecellproliferentiationandsurvivalrate.Productionofreactiveoxygenspecies（ROS）ofdrug-treatedcellsweremonitoredbyafluorescentprobe2’,7’-dichlorodihydrofluorescinfluorescence（DCFH-DA）.MorphologicalchangesassociatedwithapoptosiswereexaminedbystainingwithHoechst33258.Moreover,changesinmitochondrialtransmembranepotentialweredetermindebythedual-emissionpotential-sensitiveprobe5,5’,6,6’-tetra-chloro-1,1’,3,3’-tetraethyl-imidacarbocyanineiodide（JC-1）.ResultOxidativestressdecreasedtheactivityofSODinHSCs,increasedthecontentofMDAinHSC-T6.GSinhibitedthecellsproliferationanddecreasedtheiROSlevelsinadosedependentmanner,After24hourstreatmentwithGS,thetypicalapopticmorphologywasfoundinHSCs,includingthedecreaseofkaryoplasmicratioandtheincreaseofkidney-shapenuclearcells.Furthermore,GSinducedaconcentrationdecreaseinROSproductionandinmitochondrialmembranepotential.ConclusionGSplayanimportantroleinoxidativestressHSC-T6apoptosiswhichmaybecorrectedwithmitochondriaapoptosispathway.

　　Keywords：

Glycyrrhizauralensis;salvianolicacid;hepaticstellatecells;apoptosis;mitochondriamembranepotential

　　肝纤维化（hepaticfibrosis,HF）是慢性肝病的共同病理学基础,其中25%～40%最终发展为肝硬化甚至肝癌[1]。

目前认为,肝星状细胞（hepaticstellatecells,HSC）是HF细胞外基质的主要来源细胞,HSC的活化和功能的改变是HF形成的关键[2-3],也是抗纤维化研究的核心。

越来越多的实验表明,氧化应激是不同原因引起的HF发生的共同通路。

实际上,铁负载、乙醇、四氯化碳和丙型肝炎病毒等引起HF的病因都可通过氧化应激和脂质过氧化途径激活HSC。

Iredale等[4]的实验表明,激活的HSC主要不是通过转化为静止的HSC实现的,也并非引起坏死,因为纤维间隔及其邻近区域没有坏死及炎症的表现,而是凋亡的结果。

在急性或慢性肝损伤修复的动物模型中也发现了HSC的凋亡。

由激活的HSC分泌的金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）的表达减少,解除了对胶原酶活性的抑制使胶原降解增加,再加上HSC的减少使细胞外基质的分泌减少,两个原因使细胞外基质降解[4-6]。

那么,有针对性地诱导人HSC发生凋亡为HF的治疗提供了实际目标。

本课题建立大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）的氧化应激模型,着重研究抗氧化剂甘草总黄酮与石见穿总酚酸联合用药（GS）能否促使氧化应激的HSC凋亡,并探讨凋亡是否与线粒体凋亡途径有关。

　　1材料与方法

　　1.1试剂及细胞株

　　HSC-T6、Dulbeceo’sModafiedEagle’sMedium（DMEM,Sigma）;新生小牛血清（杭州四季青公司）;Hoechst33258（Sigma）;MTT、JC-1和DMSO（Sigma）;次氮基三乙酸铁（Fe-NTA,Sigma）;其余为国产分析纯试剂。

GS由新疆特种植物药资源教育部重点实验室提供。

　　1.2仪器

　　多功能酶标仪（Thermo3001VARIOSKANFLASH）;AR-2140型万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司制造）;CO2培养箱（Forma3110,USA）;蔡司荧光倒置显微镜。

　　1.3细胞培养

　　HSC-T6用含10%小牛血清的DMEM培养基置于37℃、5%CO2培养箱培养。

传代后培养8h即可贴壁生长;2d后细胞80%～90%铺满瓶底,即可再次传代,传至3～4代,用于实验。

　　1.4MTT法测定细胞活力

　　对数生长期的HSC-T6用含10%新生小牛血清的培养液吹打成单细胞悬液,以每孔5×104个细胞接种到96孔培养板,置于37℃、5%CO2培养箱培养24h。

细胞贴壁率达到70%后药物处理,继续培养48h。

最后每孔加MTT溶液20μL（5mg/mL）,孵育4h,终止培养,吸弃孔内培养上清液。

每孔加150μL的二甲基亚砜（DMSO）,振荡10min,使结晶物充分融解。

选择490nm波长,多功能酶标仪测定OD值。

　　1.5氧化应激模型的建立

　　对数生长期的HSC-T6经0.25%胰蛋白酶消化后,用含10%胎牛血清的DMEM培养液调整为单细胞悬液并接种于细胞培养瓶,置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

24h后细胞贴壁良好,换用含0.2%胎牛血清的DMEM培养,使其生长同步化。

当细胞贴壁率达到70%后,更换培养液并加入不同浓度的Fe-NTA（0.1、0.5、1mmol/L）。

　　1.6肝星状细胞丙二醛含量的测定

　　细胞接种于细胞培养瓶,药物处理24h,胰蛋白酶消化,PBS洗涤,离心,收集细胞。

取细胞悬液适量,采用TBA法检测细胞丙二醛（MDA）含量。

　　1.7肝星状细胞内超氧化物歧化酶活性的测定

　　细胞接种于细胞培养瓶,药物处理24h,胰蛋白酶消化,PBS润洗,液氮反复冻融,以破碎细胞膜。

加入新的PBS,在4℃、10000×g下离心15min。

取上清液用PBS稀释,制成样品溶液。

运用邻苯酸酚自氧化速率法检测超氧化物歧化酶（SOD）活性。

　　1.8细胞内活性氧的测定

　　Fe-NTA处理贴壁良好的HSC-T66h,加GS处理4h,胰蛋白酶消化,收集细胞到离心管内,PBS润洗,离心,重复2次。

加DCFH-DA至96孔板,终浓度为30μmol/L,终体积为200μL,继续孵育30min后,PBS润洗2次,于多功能酶标仪测定荧光强度,激发光为485nm,发射光为520nm[7]。

　　1.9荧光染料Hoechst33258测定细胞凋亡

　　细胞发生凋亡时,染色质会固缩,Hoechest33258染色后,在荧光显微镜下观察,正常细胞蓝色,而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染。

染液配成100μg/mL。

临用时,稀释为终浓度10μg/mL。

细胞悬液（含3～5×106细胞）1000×g、40℃离心5min。

将上清弃去,细胞于30～50μL40%（W/V）多聚甲醛中悬浮,细胞涂片干燥,将10μg/mLHoechst33258染液滴于载玻片上,避光放置10min。

将玻片侵入蒸馏水中5次进行冲洗,避光干燥。

用PBS/甘油粘片,用绿色滤光片在荧光倒置显微镜下观察。

　　1.10荧光探针JC-1测定线粒体膜电位

　　Fe-NTA处理贴壁良好的HSC-T66h,加GS处理4h,胰蛋白酶消化,收集细胞于离心管内,PBS润洗2次,加入JC-1,37℃避光孵育20min。

PBS润洗1次,离心,弃上清。

PBS重新混悬细胞,移液枪将适量细胞滴于载玻片上,盖上盖玻片,于荧光倒置显微镜下观察、拍照。

　　2结果

　　2.1对肝星状细胞增殖的影响

　　GS处理HSC,观察GS对HSC增值的影响。

随着GS浓度的增大,其对HSC的增殖抑制作用越来越明显,GS40μg/mL组与20μg/mL组相比P0.01,GS80μg/mL组与40μg/mL组相比P0.01,GS160μg/mL组与80μg/mL组相比P0.05。

结果见图1。

　　2.2氧化应激处理对肝星状细胞活力的影响

　　以相同细胞数传代与5mL细胞培养瓶内贴壁60%后,分别加0.1、0.5、1mmol/L的Fe-NTA处理HSC-T66、12、24h后,胰酶消化细胞,吹打成单细胞混悬液,台盼蓝染色3min,荧光倒置显微镜下计数。

结果表明,所选浓度的Fe-NTA对HSC-T6没有毒性作用,且细胞存活率达到95%以上。

　　2.3氧化应激对肝星状细胞丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性的影响

　　对数生长期的HSC-T6用Fe-NTA分别作用1、3、6、12、24h后,随着Fe-NTA作用时间的延长,细胞内MDA含量并非一直呈上升趋势,而是在Fe-NTA作用6h细胞内MDA含量达到顶峰,随Fe-NTA作用时间的延长,MDA含量有所下降。

同时,随着Fe-NTA浓度的增大,同一时间点的MDA含量呈增加趋势。

对数生长期的HSC-T6用Fe