甘草总黄酮与石见穿总酚酸联用促肝星状细胞凋亡作用研究.docx

1、甘草总黄酮与石见穿总酚酸联用促肝星状细胞凋亡作用研究甘草总黄酮与石见穿总酚酸联用促肝星状细胞凋亡作用研究（作者:_单位: _邮编: _） 【摘要】 目的 研究甘草总黄酮与石见穿总酚酸联用对氧化应激的肝星状细胞(HSC)的促凋亡作用。方法 MTT法检测甘草总黄酮与石见穿总酚酸联用对大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)增殖的影响。次氮基三乙酸铁与HSC-T6体外共培养建立氧化应激模型,采用TBA法检测细胞内丙二醛(MDA)含量,运用邻苯酸酚自氧化速率法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性。荧光探针DCFH-DA检测细胞内活性氧水平。荧光染料Hoechst33258观察细胞的形态及凋亡情况。JC-1检测细胞

2、内线粒体膜电位变化情况。结果 甘草总黄酮与石见穿总酚酸联合处理HSC-T6后,细胞的增殖受到抑制,并促进HSC-T6凋亡;细胞内线粒体膜电位下降;随着药物剂量的增加细胞内活性氧含量下降。结论 甘草总黄酮与石见穿总酚酸联用促进氧化应激的HSC凋亡,此作用可能与线粒体凋亡途径有关。 【关键词】 甘草总黄酮;石见穿总酚酸;肝星状细胞;凋亡;线粒体膜电位Abstract：Objective To investigate the effect of Glycyrrhiza uralensis flavonoids and salvianolic acid (GS) on the apoptosis of

3、 HSC-T6 cells. Methods HSC-T6 were incubated with ferric nitrilotriacetic acid (Fe-NTA), SOD activity and MDA content in HSC-T6 were detected. MTT colorimetric method and trypan blue staining were used to measure the cell proliferentiation and survival rate. Production of reactive oxygen species (RO

4、S) of drug-treated cells were monitored by a fluorescent probe 2,7-dichlorodihydrofluorescin fluorescence (DCFH-DA). Morphological changes associated with apoptosis were examined by staining with Hoechst33258. Moreover, changes in mitochondrial transmembrane potential were determinde by the dual-emi

5、ssion potential-sensitive probe 5,5,6,6-tetra-chloro-1,1,3,3-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide (JC-1). Result Oxidative stress decreased the activity of SOD in HSCs, increased the content of MDA in HSC-T6. GS inhibited the cells proliferation and decreased the iROS levels in a dose dependent manne

6、r, After 24 hours treatment with GS, the typical apoptic morphology was found in HSCs, including the decrease of karyoplasmic ratio and the increase of kidney-shape nuclear cells. Furthermore, GS induced a concentration decrease in ROS production and in mitochondrial membrane potential. Conclusion G

7、S play an important role in oxidative stress HSC-T6 apoptosis which may be corrected with mitochondria apoptosis pathway.Key words：Glycyrrhiza uralensis;salvianolic acid;hepatic stellatecells;apoptosis;mitochondria membrane potential肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是慢性肝病的共同病理学基础,其中25%40%最终发展为肝硬化甚至肝癌 1。目前认为,

8、肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)是HF细胞外基质的主要来源细胞,HSC的活化和功能的改变是HF形成的关键2-3,也是抗纤维化研究的核心。越来越多的实验表明,氧化应激是不同原因引起的HF发生的共同通路。实际上,铁负载、乙醇、四氯化碳和丙型肝炎病毒等引起HF的病因都可通过氧化应激和脂质过氧化途径激活HSC。Iredale等4的实验表明,激活的HSC主要不是通过转化为静止的HSC实现的,也并非引起坏死,因为纤维间隔及其邻近区域没有坏死及炎症的表现,而是凋亡的结果。在急性或慢性肝损伤修复的动物模型中也发现了HSC的凋亡。由激活的HSC分泌的金属蛋白酶组织抑制剂(TIM

9、P)的表达减少,解除了对胶原酶活性的抑制使胶原降解增加,再加上HSC的减少使细胞外基质的分泌减少,两个原因使细胞外基质降解4-6。那么,有针对性地诱导人HSC 发生凋亡为HF的治疗提供了实际目标。本课题建立大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)的氧化应激模型,着重研究抗氧化剂甘草总黄酮与石见穿总酚酸联合用药(GS)能否促使氧化应激的HSC凋亡,并探讨凋亡是否与线粒体凋亡途径有关。1 材料与方法1.1 试剂及细胞株HSC-T6、Dulbeceos Modafied Eagles Medium(DMEM, Sigma);新生小牛血清(杭州四季青公司);Hoechst33258 (Sigma);MTT、J

10、C-1和DMSO(Sigma);次氮基三乙酸铁(Fe-NTA, Sigma);其余为国产分析纯试剂。GS由新疆特种植物药资源教育部重点实验室提供。1.2 仪器多功能酶标仪(Thermo 3001 VARIOSKAN FLASH);AR-2140型万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司制造);CO2培养箱(Forma 3110,USA);蔡司荧光倒置显微镜。1.3 细胞培养HSC-T6用含10%小牛血清的DMEM培养基置于37 、5%CO2培养箱培养。传代后培养8 h即可贴壁生长;2 d后细胞80%90%铺满瓶底,即可再次传代,传至34代,用于实验。1.4 MTT法测定细胞活力对数生长期的

11、HSC-T6用含10%新生小牛血清的培养液吹打成单细胞悬液,以每孔5104个细胞接种到96孔培养板,置于37 、5%CO2培养箱培养24 h。细胞贴壁率达到70%后药物处理,继续培养48 h。最后每孔加MTT溶液20 L(5 mg/mL),孵育4 h,终止培养,吸弃孔内培养上清液。每孔加150 L的二甲基亚砜(DMSO),振荡10 min,使结晶物充分融解。选择490 nm波长,多功能酶标仪测定OD值。1.5 氧化应激模型的建立对数生长期的HSC-T6经0.25%胰蛋白酶消化后,用含10%胎牛血清的DMEM 培养液调整为单细胞悬液并接种于细胞培养瓶,置于37 、5%CO2培养箱中培养。24 h

12、后细胞贴壁良好,换用含0.2%胎牛血清的DMEM培养,使其生长同步化。当细胞贴壁率达到70%后,更换培养液并加入不同浓度的Fe-NTA (0.1、0.5、1 mmol/L)。1.6 肝星状细胞丙二醛含量的测定细胞接种于细胞培养瓶,药物处理24 h,胰蛋白酶消化,PBS洗涤,离心,收集细胞。取细胞悬液适量,采用TBA法检测细胞丙二醛(MDA)含量。1.7 肝星状细胞内超氧化物歧化酶活性的测定细胞接种于细胞培养瓶,药物处理24 h,胰蛋白酶消化,PBS润洗,液氮反复冻融,以破碎细胞膜。加入新的PBS,在4 、10 000g下离心15 min。取上清液用PBS稀释,制成样品溶液。运用邻苯酸酚自氧化速

13、率法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性。1.8 细胞内活性氧的测定Fe-NTA处理贴壁良好的HSC-T6 6 h,加GS处理4 h,胰蛋白酶消化,收集细胞到离心管内,PBS润洗,离心,重复2次。加DCFH-DA至96孔板,终浓度为30 mol/L,终体积为200 L,继续孵育30 min后,PBS润洗2次,于多功能酶标仪测定荧光强度,激发光为485 nm,发射光为520 nm7。1.9 荧光染料Hoechst33258测定细胞凋亡细胞发生凋亡时,染色质会固缩,Hoechest33258染色后,在荧光显微镜下观察,正常细胞蓝色,而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染。染液配成100 g

14、/mL。临用时,稀释为终浓度10 g/mL。细胞悬液(含35106细胞)1 000g、40 离心5 min。将上清弃去,细胞于3050 L 40%(W/V)多聚甲醛中悬浮,细胞涂片干燥,将10 g/mL Hoechst33258染液滴于载玻片上,避光放置10 min。将玻片侵入蒸馏水中5次进行冲洗,避光干燥。用PBS/甘油粘片,用绿色滤光片在荧光倒置显微镜下观察。1.10 荧光探针JC-1测定线粒体膜电位Fe-NTA处理贴壁良好的HSC-T6 6 h,加GS处理4 h,胰蛋白酶消化,收集细胞于离心管内,PBS润洗2次,加入JC-1,37 避光孵育20 min。PBS润洗1次,离心,弃上清。PB

15、S重新混悬细胞,移液枪将适量细胞滴于载玻片上,盖上盖玻片,于荧光倒置显微镜下观察、拍照。 2 结果2.1 对肝星状细胞增殖的影响GS处理HSC,观察GS对HSC增值的影响。随着GS浓度的增大,其对HSC的增殖抑制作用越来越明显,GS 40 g/mL组与20 g/mL组相比P0.01,GS 80 g/mL组与40 g/mL组相比P0.01,GS 160 g/mL组与80 g/mL组相比P0.05。结果见图1。2.2 氧化应激处理对肝星状细胞活力的影响以相同细胞数传代与5 mL细胞培养瓶内贴壁60%后,分别加0.1、0.5、1 mmol/L的Fe-NTA处理HSC-T6 6、12、24 h后,胰酶消化细胞,吹打成单细胞混悬液,台盼蓝染色3 min,荧光倒置显微镜下计数。结果表明,所选浓度的Fe-NTA对HSC-T6没有毒性作用,且细胞存活率达到95%以上。2.3 氧化应激对肝星状细胞丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性的影响对数生长期的HSC-T6用Fe-NTA分别作用1、3、6、12、24 h后,随着Fe-NTA作用时间的延长,细胞内MDA含量并非一直呈上升趋势,而是在Fe-NTA作用6 h细胞内MDA含量达到顶峰,随Fe-NTA作用时间的延长,MDA含量有所下降。同时,随着Fe-NTA浓度的增大,同一时间点的MDA含量呈增加趋势。对数生长期的HSC-T6用Fe