整理谷胱甘肽中文概述Word格式文档下载.docx
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.1谷胱甘肽的提取
谷胱甘肽的分离纯化
3.1.2
化学合成法酶合成法发酵法
谷胱甘肽(Glutathione)
1谷胱甘肽(GSH)结构与功能
1.1GSH的结构特征
GSH由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过肽键形成,分子中
有一特殊的
Y-肽键,即由谷氨酸的Y-COOH与半胱氨酸的
-NH2缩合成的肽键,它不同于蛋白质分子中的普通肽键。
GSH为白色晶体,易溶于水、低浓度乙醇水溶液、液氨和
甲基甲酰胺。
2分子GSH脱氢后以二硫键相连形成氧化型谷胱甘肽(GSSG),又称谷胱甘肽二硫化物,多以水合物形式存在,是溶于水的白色晶体。
胱甘肽的相对分子质量为
307.33;
熔点为189〜193C(分解);
溶于水、稀醇、液氨和二甲基甲酰胺,不溶于醇、醚和丙酮;
谷胱甘肽固体较为稳定,水溶液在空气中则易被氧化[5]。
两分子GSH的活泼
巯基氧化脱氢转变为一分子GSSG,但只有GSH才具有生理
活性。
理功能的结构基础。
GSH在红细胞中作为巯基缓冲剂存在,维持血红蛋白和其它红细胞蛋白质的半胱氨酸残基处于还原状态。
GSH还广泛存在于其它正常细胞中,有很强的亲和力,能与多种化学物质及其代谢物结合,清除体内氧自由
基及其它自由基,具有保护肝细胞膜、促进肝酶活性、抗氧
还在蛋白质和DNA合成、物质运输、酶活性、新陈代谢及
细胞保护等生物学功能中起着直接或间接的作用。
它还是许多酶反应的辅基,可作为抗氧化剂保护生物分子蛋白的巯基,清除体内过多的自由基,参与体内三羧酸循环及糖代谢,具有解毒、预防糖尿病、癌症及消除疲劳等作用
GSH广泛应用于食品领域,如加入酸奶和婴儿
食品起类似维生素C的稳定作用;
防止水果罐头水果褐变在
面制品中起还原和强化氨基酸作用;
缩短面包混揉时间GSH
在与谷氨酸钠、核酸系呈味物质或其混合物共存时具有肉类
风味;
GSH可抑制肉食类、鱼类和海鲜类食品的核酸分解,
八
GRV
NADP(NADPH):
氧化型(还原型)辅酶I
GR:
谷胱甘肽还原酶
在次反应中,NADPH量逐渐减少,TNB量逐渐增加,TNB
在412nm吸收增加的速率与总GSH量呈正比。
由于GSH和
GSSG循环交替,周而复始总量不变,故称此为循环法。
2.1比色法
郭黎平等⑹{郭黎平,刘国良,张卓勇,等.铜(n)-新
铜试剂-谷胱甘肽乙醇体系显色反应研究J].光谱学与光谱分
析,2000,20(30):
412-414.}在测定大豆提取液中谷胱
醇体系中测定谷胱甘肽的含量,乙醇具有明显的增敏作用。
采用CuS04溶液和新铜试剂混合液[Cu2+-新铜试剂(1:
2.5,
2.0ug/ml,线性范围为2.0〜24ug/ml,回收率为99.54%,RSD
为0.76%。
赵旭东等[2]{赵旭东,魏东芝,万群,等,谷
胱甘肽的简便测定法J].药物分析杂志,2000,20
(1)
34-37}根据甲醛同谷胱甘肽和常见含巯基物质反应速度的不
同,提出了在含有其它巯基物质溶液中测定谷胱甘肽含量的方法,通过控制两个相同供试品和甲醛的不同反应时间,测定两者在波长为412nm时的吸收度,根据两者不同的吸收度
值得出谷胱甘肽的含量。
线性范围为0.19〜0.95g/L,回收率为
96.7%,方法的结果误差小于0.5%。
该方法实验成本低,分析
快速、简单,适于测定生物合成反应液中谷胱甘肽的含量。
2.2荧光法
曹新志等[7]{曹新志,陈彦.荧光法测定黄瓜中的谷胱甘肽
[J].资源开发与市场,2000,16(5):
272-273。
}采用邻苯
甲醛(0-PhthaldialdehydeQPT)作为络合剂,在磷酸缓冲液(PH8.0)中,应用荧光分光光度计来测定黄瓜中谷胱甘肽
的含量。
检测限为0.1ug/ml,线性范围为0.1〜40ug/ml,回
收率为99.73%,RSD为1.24%。
Hissin等[8]选用OPT作荧光剂,采用偏磷酸-磷酸钠-EDTA缓冲溶液(PH8.0),用以测定哺乳动物心脏和肝脏中谷胱甘肽的含量,谷胱甘肽的检测限为0.05umol,线性范围为0.05〜0.8umol,RSD为4%。
张
建莹等[9]{张建莹,齐剑英等,锌离子增强荧光光谱法测定谷胱甘肽[J].暨南大学学报,2004,25
(1):
88-91}探
讨了金属离子对还原型谷胱甘肽(GSH)-邻苯二甲醛(OPA)体系荧光信号的影响,实验结果表明Zn2+对体系的荧光信号有增强作用,而且Zn2+能够提高GSH-OPA体系的稳定性,
据此建立了一种以Zn2+作为荧光增强剂,快速简便测定还
原型谷胱甘肽的新方法。
GSH在1.3X10-8〜1.4X10-6mol/L
的范围内其浓度与体系相对荧光强度有良好的性关系,出限为1.1X10-8mol/L.本实验方法比较适合生物样品中还原
型谷胱甘肽浓度的测定。
2.3高效液相色谱法(HPLC)
HPLC是近年测定复杂生物样本中各种巯基物的最好主法。
HPLC过程是溶质在固定相和流动相之间由于分配系数、吸
附能力、亲和力、分子大小不同,进行连续分离的过程。
HPLC法优点是可以区分开GSH、GSSG及20多种含巯基
得低于50umol/L;
且样本的前处理过程耗时,测定大样本时
不方便,所用的柱特殊[5]{攀跃平,于健春等,谷胱甘肽
杂志,2003,11
(2):
136-139}。
A.Rodrigueuz-Ariza
等[10]ArizaAR,TonbioF,BareaJL.RapiddeterminationofglutathionestatusinfishLiverusinghigh-performanceliquidchromatographyandelectrochemicaldedection[J].Journalof
ChromatographyB,1994,656:
311-318介绍了一种结合电化学法快速测定谷胱甘肽水平的方法。
该法应用一套双通道电化
学测定仪,可同时测定GSH、GSSG还可测定PSSG(蛋白结合
Chung-shiYang等介绍了一种将HPLC与微透析机联机测定
谷胱甘肽。
此法缩短了分析测定时间,简化了样本的准备过
程,并提供了连续的监测[5]{攀跃平,于健春等,谷胱
营养杂志,2003,11
(2):
136-139}程敬君等采用KCI
(工
溶液-HCI溶液-甲醇-EDTA为流动相,电化学检测器
0.9V),测定鼠脑微透析液中谷胱甘肽的含量,检测限为10nmol/L,回收率为87.3%,RSD为1.8%。
Brent等用甲醇和乙
2002,23
(1):
52-54}
412nm波长有最大吸收峰。
方法:
样品1式2份,pH8.0条
件下分别和甲醛反应2min和60min,各取1mL加入5mLDTNB溶液,25C反应5min后分别测定在波长412nm
的吸光度,算出2者的差值^A,代入标准曲线计算得出谷
胱甘肽含量。
得到谷胱甘肽浓度在0.19〜0.95gL-1之间线性
关系良好,回归方程为:
丫=0.7154X-0.0004,r=0.9999,
最大误差不超过6%。
本方法成本低廉,简单易行,特别适
法中,反应显色后30min以内光密度未见降低,显色稳定。
相对误差可以控制在2%以内,相对标准偏差可以控制在4%
以内,说明这种方法的准确度和精密度较高,且半胱氨酸不
干扰测定结果。
刘娟等[15]{刘娟,王雅琴等.发酵液中还原
型谷胱甘肽三种测定方法的改进及其比较J].北京化工大学
学报,2004,31(3):
35-38}对此方法应用于发酵液中还原
mL0.15mol/LNaOH溶液中,摇匀,加入体积分数$=0.03,
甲醛0.5mL,摇匀,静置2min。
加入2.5mLDTNB分析溶
液,摇匀,在25C水浴保温5min,测定在波长412nm处
DTNB法经改进后,其灵敏度比原先提高了三倍。
另外,蓝金贵等报道了一种快速、简便和廉价的谷胱
甘肽(GSH)含量测定的新方法。
利用GSH的还原性将磷
钼杂多酸还原成磷钼杂多蓝,在710nm最大吸收波长处测
其吸光度,吸光度与GSH的浓度在3.3X10-7-1.3>
10-4mol/L
范围内呈线性关系,相关系数r=0.9982,方法检测限为1.6X
结果满意。
2.5碘量法
2.5.1原理:
本法是利用GSH的还原性与碘酸钾反应,当
GSH全部反应完时,碘酸钾将碘化钾氧化为碘,碘使淀粉
指示剂变为蓝色,即为滴定终点。
碘酸钾消耗量与GSH的
含量成正相关,由此制作标准曲线。
再用碘酸钾滴定以不同
方法提取的被测样品,根据所消耗碘酸钾的量(mL),从曲线
上找出相应的GSH质量浓度(g/L),计算每g干酵母中
GSH的质量分数。
2.5.2制作GSH标准曲线:
首先配制1g/L的GSH标准
溶液,然后取GSH标准溶液于250mL锥形瓶内,加入5mL质量分数2%的偏磷酸溶液、1mL质量分数5%的碘化
钾溶液和2滴淀粉指示剂,用0.0001mol/L的碘酸钾溶液滴
定至溶液由无色变为蓝色止,记录碘酸钾体积(如表2所
示)。
重复2次,取平均值,以GSH质量浓度(g/L)为横坐标,
碘酸钾消耗量(mL)为纵坐标,制作标准曲线,
由于谷胱甘肽具有重要的生理功能和广泛的市场前景
甘肽的研究还处于起步阶段,还没有批量生产能力。
谷胱甘
法和发酵法。
溶剂提取法主要是以富含谷胱甘肽的小麦胚芽和酵母等为
经分离纯化后精制而成。
溶剂提取法生产谷胱甘肽早已工业
产品质量不高。
因此,未来研究的重点应该放在提高提取效
率以及选择适宜的纯化方法以提高产品的质量和产量。
3.1.1谷胱甘肽的提取
和乙醇浸提溶剂提取谷胱甘肽,结果表明热水浸提是最理想
的方法。
安贤惠[21]以安琪活性干酵母为研究对象,用热水
抽提、甲酸抽提、乙醇抽提、低温抽提方法提取谷胱甘肽,结果表明热水抽提法的提取效率最高。
3.1.2谷胱甘肽的分离纯化要制取高纯度的谷胱甘肽还需进一步在提取法中组合离子
交换层析和吸附层析等方法进行纯化。
周惠明等[22]采用离
子交换分离法,对经膜分离后得到的小麦胚芽水溶性提取物
件下,回收率为79.55%。
3.2化学合成法
谷胱甘肽的方法。
目前谷胱甘肽的化学合成生产工艺已较成
杂等缺点,更重要的是通过化学合成法得到的谷胱甘肽是左
旋体和右旋体的混合物,需要进行光学拆分,分离十分困
难,由此造成了产品纯度不高,并且存在着环境污染等问题因此限制了其应用[8]
3.3酶合成法
酶合成法是以L2谷氨酸、L2半胱氨酸及甘氨酸为底物
利用生物体内的天然谷胱甘肽合成酶,并添加少量ATP来
合成谷胱甘肽的方法[24]。
谷胱甘肽合成酶大多取自酵母菌
和大肠杆菌。
肖强等[25]以通过特定诱变筛选的能高产含
GSH2I和GSH2II的CGMCC1231菌株为酶源,以L2谷氨
酸、L2半胱氨酸、甘氨酸为底物,并加入葡萄糖和硫酸镁
以上,产品纯度质量分数在98%以上。
酶转化法生产谷胱甘
肽工艺明确,产品纯度较高,但是操作较复杂,而且需要底
阶段。
3.4发酵法
代谢将廉价原料转化为谷胱甘肽的方法。
发酵法生产谷胱甘
肽的微生物大多是酵母和大肠杆菌。
发酵法与以上3种方法
快等。
但是由于谷胱甘肽是胞内产物,含量不高,因此,发酵
法生产谷胱甘肽的关键技术在于如何提高细胞密度及胞内谷胱甘肽含量[27]。
目前发酵法已成为生产谷胱甘肽最普遍
刘娟等[15]{刘娟,王雅琴等.发酵液中还原型谷胱甘肽三种测定方法的改进及
其比较[J].北京化工大学学报,2004,31(3):
35-38}对此方法应用于发酵液中还原型谷胱甘肽的测定稍作改进如下:
将分样品0.5mL加入1.5mL
0.15mol/LNaOH溶液中,摇匀,加入体积分数©
=0.03甲醛0.5mL,摇匀,静置
2min。
加入2.5mLDTNB分析溶液,摇匀,在25E水浴保温5min,测定在波长412nm处的吸光度A,通过计算或从标准曲线上得出相应GSH浓度。
DTNB
法经改进后,其灵敏度比原先提高了三倍。