克隆策略复习题及答案docWord格式.docx

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9.一旦克隆了一个遗传定位的基因，就可以用染色体步移技术来鉴定基因组DNA文库中与之相邻的基因克隆。

10.只要知道基因组中某一特定区域的部分核昔酸组成，用聚合酶链式反应（PCR）可以将这段DNA进行百万倍的扩增。

11.SD序列是mRNA分子中同核糖体RNA结合的序列，其结构特征

是AGGAGG的全部或一部分。

12•环状质粒的转化效率很低，通常是线性双链DNA转化效率的1%。

13.cDNA技术是进行真核生物基因克隆的一种通用方法，因为它可

以用mRNA为模板，通过反转录合成一个双链的.无内含子的基因，因而有利于在原核细胞中进行功能表达。

14.产生平末端的方法通常有：

①平切的酶；

②S1核酸酶切除黏性末端；

③DNA聚合酶补平黏末端。

15・人工感受态的大肠杆菌细胞在温度为0°

C时吸附DNA,42°

C时

摄入DNA。

16.影响酶切的主要因素之一是底物DNA,底物的影响包括DNA的浓度、DNA的纯度.DNA的二/三级结构、识别位点和邻近的特异性

17・Sall是识别6个核昔酸的酶，其识别切割的理论值是4096个

碱基就有一个切点，但在哺乳动物中，大约300kb才有一个切点。

18.在精简基因组文库中，用标记的突变体DNA同未标记的野生型

DNA杂交，最后建成的是缺失部分的DNA库。

19.构建基因组文库时连接方法主要是粘性末端连接法;

而构建cDNA文库，可用接尾连接法或人工接头连接法。

20.将携带有外源基因并能持久传递给子代的动物称为转基因动物,这些外源基因就叫做转移的基因o

21・为了提高重组DNA分子对Ecoli的转化效率，通常可采取

CaC12处理和42°

C处理2min。

22.含有多种限制性内切核酸酶识别序列的DNA片段称为多接头/MCS/多克隆位点。

23・两个基因融合所编码的新蛋白称为融合蛋白。

二、选择题（单选或多选）

1・重叠群（contig）是一群克隆，在这个克隆群体中每个个体（A）。

A.相互之间部分重叠B.都是来自不同生物的克隆

C.插入片段位于不同染色体的不同区段D.位于同一染色体的不同

区段

2.根据构建方法的不同，基因文库分为基因组文库、cDNA文库等。

在下列文库中

（c）属cDNA文库。

A.YAC文库B.MAC文库

C.扣减文库D.BAC文库

3.下面关于多克隆位点（MultipleCloneSite,MCS）的描述，不正

确的一项是（A）o

A.仅位于质粒载体中B.具有多种酶的识别序列

4.

部分填补是DNA体外重组中常用的一种技巧，填补时应（C）。

C.限制dNTP的种类D.注意只能填补载体

5.EcoRI切割载体DNA和供体DNA所产生的片段在用于重组连接前要（B）。

A.用65°

C处理5〜lOmin使限制性内切核酸酶失活B.用CIP处理载

体DNA防止自身环化

C.进行琼脂糖凝胶电泳检测D.上述说法都正确

6.

在cDNA技术中，所形成的发夹环可用（C）。

A.产生新切点B.易于回收外源片段

C.载体不易环化D.影响外源基因的表达

9.关于DNA接头在基因工程中的作用，下列说法中哪一项不正确?

A.给外源DNA添加适当的切点B.用于人工构建载体

C.调整外源基因的可读框D.增加调控元件

10.DNA的结构对转化的影响很大，一般说来，转化效率最高的是（A）。

A.完整的线性双链DNAB.单链线性DNA

C.完整的环状双链DNAD.开口的双链环状DNA11.cDNA文库包括该种生物的（A）。

A.某些蛋白质的结构基因B.所有蛋白质的结构基因

C.所有结构基因D.内含子和调控区12・下列关于建立cDNA文库的叙述中，哪一项是错误的？

（A）

A.从特定组织或细胞中提取DNA或RNAB.用反转录酶合成mRNA的

对应单链DNA

C.以新合成的单链DNA为模板合成双链DNAD.新合成的双链DNA甲

基化

13・下列对黏性末端连接法的评价中，哪一项是不正确的？

（C）

A.操作方便B.易于回收片段

C.易于定向重组D.载体易于自身环化，降低重组率

14.关于感受态细胞性质的描述，下面哪一种说法不正确？

A.具有可诱导性B.具有可转移性

C.细菌生长的任何时期都可以出现D.不同细菌出现感受态的比例

是不同的

15・以下哪些信息无法从cDNA克隆中获得？

（B）

A.外显子序列B.启动子序列

C.序列的相似性D.编码产物的氨基酸序列

E.剪接的DNA转录产物16.从人基因组中分离、克隆一个基因所要面临的一个基本问题是:

基因组大小有（D）碱基对，而一个基因长度通常只有（D）碱基

对。

A.几万亿，几百万B.几万亿，几千

C.几十亿，几百万D.几十亿，几千

三、判断题

1.外源基因（或DNA片段）插入到某一基因内的位点后，这个基因

不再有任何功能。

错误，有可能具有新功能

2.用不同的产生黏性末端的限制性内切核酸酶分别切割载体和外源

DNA,得到的黏性末端是不亲和的黏性末端。

错误，同裂酶也能产生

黏末端

3.基因组DNA文库是含有某一生物中全部DNA序列随机克隆的克隆群，而cDNA文库是含有某一生物中所有表达基因随机克隆的克隆群。

错误，cDNA文库只含有构建文库的细胞类型中表达的基因，为某阶段.时期.组织中表达的基因

4.cDNA克隆较之基因组克隆最重要的优越性就是它们含有一个基因

的完整序列。

错误，无内含子

5.通过差示杂交后制备的cDNA文库使克隆那些只在特定分化细胞中

表达基因的概率大为提高。

正确

6.在染色体步移中，可通过DNA测序知道已到达所感兴趣的基因。

错误，通过转基因实验鉴定

7.一旦有了一套已知顺序的基因组克隆，通过从文库中获得覆盖目的突变基因所在基因组区的所有克隆，就可以进行染色体步移。

正确,

8.根据遗传连锁作图把基因定位在基因组中是定位克隆的第一步,它为分离特定的人的基因提供了一个直接而快速的方法。

错误，需10-100人做多年才能分离一个人的基因9•人工感受态和自然感受态细胞都能吸收线性和环状单链DNA。

错误,自然态不能吸收环状单链DNA

10.人工导入基因和正常染色体基因间的同源重组，可以发生基因1

换。

11.线性DNA片段被导入哺乳动物细胞后，在细胞内酶的作用下，很快相互连接成重复的DNA大片段，并能在随机位点整合到染色体中。

12・不匹配的黏性末端是不能通过黏性末端连接的。

错误，可通过部

分填充后得到黏末端

13.用限制性内切核酸酶切割载体DNA.供体DNA后，要加入EDTA-SDS

终止液使限制性内切核酸酶失活，这样有利于重组连接。

错误，

EDTA-SDS终止液会抑制连接酶活性14.限制性内切核酸酶加H识别的序列为AJGATCT,BanilI识别的序列为GIGATCC,用它们分别切割载体DNA和供体DNA,不必使酶失活就可以直接通过黏性末端连接法进行连接。

正确，连接后不再被两个连接酶识别

15.具有尿oRI末端的外源DNA片段可以以两个方向插入到尿oRI

末端的载体中。

16.不匹配的黏性末端可以通过部分填补后进行连接。

正确17・低丰度的mRNA不仅拷贝数少，而且种类也少。

错误，种类多18.同聚物接尾法构建重组体，不仅连接效率高，而且也很容易回收

插入的片段。

错误，不易回收

19.含有真核生物可诱导启动子和多克隆位点的自主复制的载体DNA

被称为表达载体。

4.问答题

1.怎样将一个平末端的DNA片段插入到屁oRI的限制位点中去?

答：

可以化学合成一个连接子（linker）,即一段长为10bp含有EcoR

I识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果

用EcdRI切割这种连接片段，就会产生EcoRI的单链末端。

这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性核酸内切酶位点中。

2.构建基因组文库时为什么要对基因组DNA进行部分酶切？

（列举

至少两条理由）答：

①部分酶切可获得长度适宜的片段（如获得中等长度的酶切片段）；

②部分酶切可保证切出的DNA片段内部依然保留了部分限制酶位点，便于后续的克隆分析。

3.什么是基因组文库（genomiclibrary）?

它同遗传学上的基因库有

什么不同?

基因组文库是用基因工程的方法，人工构建的含有某一生物基因组DNA的各种片段的克隆群。

包括下列过程：

高分子质量染色体DNA的制备；

体外重组连接；

将重组DNA导入寄主细胞并扩增；

筛选。

基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。

基因库（gene

pool）是指在进行有性生殖的某一群体中，能进行生殖的个体所含总的遗传信息。

在基因组文库的构建中，由于使用的载体不同，分为噬

体载体和黏粒载体构建的基因组文库、YAC文库、BAC文库等。

4.什么是cDNA文库？

同基因组文库有何差别?

同mRNA互补的DNA称为cDNA。

cDNA文库是以某一生物的总mRNA为模板，在无细胞系统中，在反转录酶的作用下，首先合成一互补的

DNA,即第一链，破坏RNA模板后，再以第一链为模板合成第二链,

得到的双链DNA称为cDNA。

选用适合的载体，将合成的cDNA重组导入寄主细胞,经筛选得到的cDNA克隆群称为cDNA文库。

由于cDNA技

术合成的是不含内含子的功能基因，因此是克隆真核生物基因的一种通用方法。

由于细胞内的基因在表达的时间上并非是统一的，具有发育的阶段性和时间性，有些则需要特殊的环境条件。

所以，cDNA文库是不可能构建得十分完全的，也就是说，任何一个cDNA文库都不可能包含某一生物的全部编码基因o

cDNA文库与基因组文库的主要差别是：

（1）基因组文库克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列；

cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因，包括调节基因。

（2）基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响；

cDNA文库

克隆的是不完全的编码DNA序列，因它受发育和调控因子的影响。

（3）基因组文库中的编码基因是真实基因，含有内含子和外显子；

而cDNA克隆的是不含内含子的基因。

5.什么是同聚物加尾连接法（HomopolymerTailsJoining）?

用

何种方法加尾？

具有哪些优缺点?

答:

所谓同聚物加尾法就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的

3,端各加上一段寡聚核昔酸，制成人工黏性末端，外源DNA和载体

DNA分子要分别加上不同的寡聚核昔酸，如dA（dG）和dT（dC）,然

后在DNA连接酶的作用下，连接成为重组的DNA。

这种方法的核心是利用末端转移酶的功能，将核昔酸转移到双链DNA分子的突出或隐蔽的3'

-0H上。

以Mg2+作为辅助因子，该酶可以在突出的3'

-0H端逐个添加单核昔酸，如果用Co2+作辅助因子，则可在隐蔽的或平末端的3’-0H端逐个添加单个核昔酸。

同聚物加尾法实际上是一种人工黏性末端连接法，具有很多优点：

①首先不易自身环化，这是因为同一种DNA两端添加的序列是相同的，所以不存在自身环化；

②因为载体和外源片段的末端是互补

的黏性末端，所以连接效率较高；

③用任何一种方法制备的DNA都可

以用这种方法进行连接。

同聚物加尾法也有一些不便之处:

①方法繁琐;

②外源片段难以回收。

由于添加了许多同聚物的序列，可能会影响外源基因的表达。

另外要注意的是，同聚物加尾法同平末端连接法一样，重组连接后往往会产生某种限制性内切核酸酶的切点。

，

6.如何使用甲基化酶对克隆DNA进行保护？

有什么意义?

在构建基因文库时，可用与接头中限制性内切核酸酶相应的甲基化酶对克隆DNA先进行甲基化修饰，将插入片段上该酶可能的识别序列先行保护起来。

意义：

用这种方法，不仅保护了插入片段的大小不会改变，又有利于插入片段的回收，因为插入片段中特定限制性内切核酸酶的识别位点被保护起来,重组后可以用特定的限制性内切核酸酶将插入片段回收。

7.何为稀有酶？

（举例说明）

所谓稀有酶是指那些识别序列在基因组DNA中不常见的酶，因此它们的切割频率较低。

如

Not\就是最常用的稀有酶，它的识别序列为GCIGGCCGCo另外有些

酶的识别序列虽然不长，但它的识别序列很特别，在基因组出现的频率较低。

如Mt/I（TCGCGA）

和〃ssHII（GCGCGC）,它们的靶

序列在哺乳动物基因组中出现的频率极低o

8.某一质粒载体具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因内有一

BglI的酶切位点。

现用刚7I切割

该载体进行基因克隆，问：

①转化后涂皿时应加什么样的抗生素？

②培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型？

③如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体?

提示：

①加四环素；

②TetrKans和TetrKanr；

③重新点种在含Tet、Kan和只加Tet的平板上，选择只在Tet平板

上生长的菌落，即为所需的重组体。

9.限制性内切核酸酶滋田1和Fs门切割某一DNA序列，结果如下

10.

所示。

⑵如果你将切割后的DNA同DNA聚合酶、4种dNTP在一起温育,这些DNA末端会有什么样的变化?

（3）经过

（2）中的反应后，你还能够用T4DNA连接酶将〃嗣I末端

连接起来吗？

PstI末端呢?

（T4DNA连接酶能够连接平末端和黏性末端。

）

（4）在（3）中的连接后，能够重新形成〃泅I位点吗？

PstI位点呢？

为什么？

（1）切割后分子的5,和3,端（如图示）：

⑵如图所示，BanilI的末端能够被DNA聚合酶填补，而PstI的末端却不能。

这种差异是由DNA聚合酶的作用条件所决定的：

dNTP只加到具有3'

-OH的引物上，并且要有一条保证正确添加的模板链。

BanHI的末端可以满足这些条件，但用方I的末端却不能，因其具

有隐蔽的5,端，这种末端是不能作为引物的，故不能被填补。

（3）如图所示，平末端化的〃嗣I末端和未被修饰的Ps方I末端二者都能被T4DNA连接酶连接。

（4）连接处理过的末端可以再产生用门的位点，但不会产生於嗣I

的位点（画图说明）。

切割.

填补末端并重新连接，常会产生新的限制酶酶切位点，这些位点对于进一步的操作有时是有用的。

11.从基因组DNA文库中分离的一段DNA（如下图所示）,其中有一编码基因（黑框），图中给出了几种限制性内切核酸酶的作用位点。

该图同时给出了用作表达该基因的表达载体，弯曲箭头是启动子

的转录方向，并给出了几种酶的作用部位。

请根据此图，回答下列问题:

（1）给出限制性内切核酸酶用方I、BanilI.EcoRI>

Hin^I和67^

I所在部位的遗传学名称。

（2）如果你打算用该表达载体表达DNA片段中的基因，该片段应如何

插入表达载体?

（3）如果只想表达该基因的一部分，以获得部分表达的蛋白质用于制

备抗体，应如何操作?

（4）如果你需要将整个基因在表达载体中表达，应如何操作？

是用单

酶切还是双酶切?

（1）多接头区域（MCS）,也叫多克隆位点。

（2）主要是插入的方向问题。

因为启动子的转录方向必须与基因的方

向一致，所以该DNA必须倒

转180。

插入，即5’端必须紧挨启动子。

（3）用屁oRI切割载体和基因组DNA,用连接酶重组后筛选重组体,

通过测序确定正确方向的重组体进行蛋白质表达。

⑷可用用方1和HindIII双酶切割基因组DNA和表达载体DNA,这

种切割可将基因组DNA片段定向克隆入表达载体。