利用酵母双杂交系统筛选油菜ATP6的相互作用因子图文精Word格式文档下载.docx

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关键词:

酵母双杂交;

细胞质雄性不育;

ATP6;

RING指结构;

泛素2蛋白降解途径中图分类号:

Q81　　　文献标识码:

A

IdentificationoftheinteractingpartnersofATP6inBrassicanapus

byusingtheyeasttwo2hybridsystem

YUEYu2fei,LIUZhi2bin,WANGJian2mei,XIANGJun2bei,

WANGYan,LIXu2feng,YANGYi

（KeyLabratoryofBio2ResourcesandEco2environmentofMinistryofEducation,

CollegeofLifeScience,SichuanUniversity,Chengdu610064,China

Abstract:

Thecytoplasmicmalesterile（CMSlineofBrassicanapuspol.isofgreatresearchutilityamongtherapeseedsterilelines.ResearchesofitsmolecularmechanismhassubstantiatedthatATP6,subunitoftheATPsynthase,isrelatedwithCMS.Byusingofyeasttwohybridsystem,ATP6waschosenasbaitproteintoscreenitsinteractingpartners.Afragment,whichhashighidentitywithanunknowngenefromArabidopsis

thaliana（AT3G47550,wasthereforefound.ThegenefragmenthasthestructureofRINGHC,whichsug2

gestsitspossiblefunctionbetweenubiquitin2proteasomepathwayandCMS.Thispaperwouldfurtherthedis2cussion.

Keywords:

yeasttwohybrid（Y2H,cytoplasmicmalesterility（CMS,ATP6,RINGfinger,ubiquitin2pro2teasomepathway

1　引　言

植物花粉败育的现象称为雄性不育.根据遗传

特点可分为核基因控制的核不育和细胞质遗传因

素控制的细胞质不育（CytoplasmicMaleSterity,CMS.CMS植株长有缺陷的雄花,但雌花器官正

2007年8月　第44卷第4期四川大学学报（自然科学版

JournalofSichuanUniversity（NaturalScienceEdition　Aug.2007Vol.44　No.4

常,营养体部分也没有缺陷,它不能产生可育花粉,并且与正常花相比其结构发生了重大改变.油菜CMS类型根据细胞质来源可分为两类,一类是植物自然繁殖过程中因突变或品种间杂交产生的;

另一类是通过种属间远缘杂交或原生质体融合而又核置换引起的.波利马（Polima胞质不育系（Pol.属于前一种类型.根据目前分子水平的研究,越来越多的证据表明,线粒体DNA（mitochondrialDNA,mtDNA及其表达产物与直关[1].早期关于

质基因（

这就表明线粒体基因是与CMS相关的[2].线粒体DNA对于CMS的影响:

一是致使植株呼吸效率降低;

二是会导致花型的改变和花粉结构的缺陷.其中前者是主要影响.有一种假定认为是CMS基因致使线粒体功能受到削弱从而无法满足花及花粉形成过程中某些途径较高的能量需求和特殊的代谢需求,其他组织并没受到影响是因为它们并不需要如此高的线粒体活性,或者是因为CMS基因仅仅在雄花器官的发育过程中高效的表达[3].ATP6是线粒体ATP合成酶的一个亚基,其对能量代谢的影响可能是导致花粉败育的一个重要原因.Homme和Brown认为,ATP6基因是CMS敏感部位[4].线粒体ATP6转录本的编辑在一种CMS高粱的雄性器官中（非幼苗中大大降低[5].ATP6基因的编辑发生改变与水稻中的CMS相关[6].ATP6的RNA编辑发生改变与编码区域发生点突变的结果类似,都会导致严重的人类疾病.在油菜Pol.中与CMS相关的mtDNA位点为ORF224/ATP6[7].对甘蓝型油菜体细胞杂种的分析表明,Pol.CMS胞质不育的杂种后代都含有ORF224/ATP6基因座位,这一基因座位与Pol.CMS性状是高度连锁的[8].在Pol.CMS系中,ORF224与ATP6两者“共转录（cotranscribe”产生2.2、1.9和1.1kb的3个mRNA转录本,而正常可育胞质只产生1个ATP6转录本.育性恢复基因可增加1.1kbmRNA转录本的量,2和1.9kb1.4和3].

ATP6作为,cDNA文库,发现与ATP6相互作用的蛋白质,进而深入探索ATP6及其相关基因的功能,以期为CMS找到注解.

2　实验材料与方法

2.1　实验材料

AH109酵母菌株、pGBKT7253、pGADT72REC载体、pGBKT7载体、甘蓝型油菜“波里马”细胞质雄性不育系的恢复系84100218幼叶和鲑鱼精担体DNA,酵母培养用的YPDMedium、SDMinimalmedium、2TrpDOSupplement、2LeuDOSupple2ment、2Leu/2TrpDOSupplement、2Leu/2Trp/2HisDOSupplement、2Ade/2His/2Leu/TrpDOSupple2ment均购自CLONTECH.硫酸腺嘌呤（Adeninehemisulfate购自Gibco;

PEG3250和Iyticase购自Sigma;

DMSO购自AMRESCO;

DH5α大肠埃希菌菌株、X2Gal、PCR用的试剂及T4DNA连接酶购自Takara公司.其他常规分子生物学试剂购自成都博瑞克生物技术公司.

2.2　方　法

2.2.1　目的基因扩增及诱饵载体的构建　根据NCBI上已发表的甘蓝型油菜ATP6序列设计一对引物

　　　　　Sense:

5π2CTATGAATCAAATAGGGCTGGT23π　　　　　　　　　　　BamHⅠ

　　　　　Antisense:

5π2AAAATGGAGATTTATAGCATCATTC23π　　　　　　　　　　　　　PstⅠ

　　利用CTAB法提取油菜总DNA,使用上述引物和模板扩增基因ATP6.PCR反应条件是94℃2min;

94℃30,57℃30,72℃1min,共35个循环;

72℃延伸10min,8℃10min.

胶回收PCR产物.用BamHⅠ和PstⅠ酶切扩增到的ATP6和克隆载体pGBKT7,利用胶回收试剂盒回收大、小片断.T4DNA连接酶连接大小片断,并转化大肠杆菌DH5α.

2.2.2　dscDNA文库构建　取甘蓝型油菜“波里马”细胞质雄性不育系的恢复系84100218幼叶按照张年辉等的方法提取总RNA[10],其浓度为4.9329

第4期岳渝飞等:

利用酵母双杂交系统筛选油菜ATP6的相互作用因子　

×

10-6g/μL,OD260:

OD280=2.125.双链cDNA合成完全按照CLONTECH的“BDMactmakerTMLi2braryConstruction&

ScreeningKits”用户手册进行,之后使用BDCHROMASPIN纯化产物.2.2.3　酵母细胞转化及阳性克隆筛选　下述步骤完全按照CLONTECH提供的方法.从DH5α中抽提质粒pGBKT72ATP6,利用PEG/LiAc法转化酵母细胞AH109细胞,SD/2Trp缺陷培养基30℃培养4d.挑单克隆于液氮中冷冻后Z

中孵育8h,p]

G2和GBKT72Lam载体的YH109菌株作感受态细胞,将dscDNA和pGADT2Rec共转化已含有pGBT72ATP6的AH109感受态细胞.同时设立正对照:

SV40LargeTPCRFragment和pGADT72RecpGBKT7253共转化携带pGBKT7253的菌株形成AH109[pGADT72RecT+pGBKT7253];

负对照:

AH109[pGADT72RecT+pGBKT72Lam].转化了的酵母细胞在选择性平板培养基SD/2Leu/2Trp/2His上培养4~10d,能生长起来的即是一些候选His3阳性克隆.再将这些候选阳性克隆在SD/　Ade/2Leu/2Trp/2His平板上30℃培养3~8d,之后用滤纸印迹法来检测菌落中LacZ报告基因的表达（β2半乳糖苷酶活性,以剔除部分假阳性克隆.然后提取阳性克隆质粒,转化大肠杆菌DH5α,在含Amp的LB平板培养,能生长的即含阳性AD克隆质粒.提取质粒.质粒PCR检测以合并重复片断,分别使用TaqⅠ和BsuR1酶切剔除相同片断.挑菌,液体LB+Amp扩大培养,送公司测序.

2.3　生物信息学初步分析

将测序结果在NCBI上进行蛋白和氨基酸比对,寻找同源序列,预测基因功能,为克隆基因全长及其深入研究打下基础.

3　实验结果

3.1　构建ATP62BD诱饵酵母菌株

利用PCR法扩增得到的油菜Pol.ATP6基因（图1,除去两端酶切位点和保护碱基,共786个碱基,同NCBI上注册的序列完全一致.成功构建了pGBKT72ATP6载体（图2,并转入酵母细胞AH109,在选择性平板培养基SD/2Trp筛选获得携带pGBKT72ATP6诱饵载体的AH109,菌落表面有光泽,呈丘状隆起,表明ATP6对酵母无毒性;

AH109（pGBKT72ATP6单克隆经液氮处理后,在Z缓冲液/X2gal中孵育8h颜色不变蓝,说明

ATP6蛋白无自发激活LacZ报告基因的能力.

图1　PCR扩增得到的含两端分别含BamHⅠ、PstⅠ酶切位点和保护碱基的ATP6基团

Fig.1　ThecompleteATP6codedsequencewithBamHⅠ、Pst

Ⅰrestrictionsitesandprotectionbasesonthetemini

图2　使用BamHⅠ和PstⅠ双酶切pGBKT72ATP6载体得到的电泳图

Fig.2　AgaroseelectrophoresisanalysisofvectorpGBKT72ATP6digestedbyBamHⅠandPstⅠafterATP6fragmenthasbeensubclonedintopGBKT7vector

3.2　利用共转化筛选了甘蓝型油菜cDNA经共转化得到的酵母阳性克隆共1087个（图3为多个长出菌落的SD/2Ade/2His/2Leu/2Trp平板中的一个,使用滤纸印迹法菌落检测LacZ报告基因的表达,8h内变蓝的有797个,其中包括正对照;

负对照8h内不变蓝.图4为其中一张滤纸X2gal显色检测的结果.

429四川大学学报（自然科学版第44卷

图3　

在SD/2Ade/2His/2Leu/2隆

Fig.3conSD/2Ade/His/2

图4　LocZ报告基因表达分析

Fig.4　ExpressionanalysisofLacZreporter

genefilterassay

图左上方正对照显示为蓝色,负对照不显色,其余显色为蓝色的是筛选到的阳性克隆

3.3　阳性克隆插入片断PCR检测

按照pGADT72REC插入片断两端的SMARTⅢ位点和CDSⅢ位点分别设计上游引物（5π2CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC23π和下游引物（5π2GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAG2

TATCTAGAT23π,按照程序:

94℃2min;

94℃30s,64℃30s,72℃2min,共35个循环

;

72℃延伸10min,8℃10min.并以阳性克隆pGADT72REC

质粒为模板进行PCR（图4为检测结果的一个部

分,以合并重复片断,分别使用TaqⅠ和BsuRⅠ酶切剔除相同片断.最后总共得到122个大于500bp的不同大小的基因片断,图5为其中的一部分.

5pGADT72Rec阳性克隆PCR质粒

检测的部分结果

Fig.5　Agaroseelectrophoresisanalysisofpositive

pGADT72Recclones

ThesecondbandfromlowertoupperofMarkerⅢstandsfor500bp

3.4　测序结果及序列分析

将筛选到的基因片断放到NCBI上进行核酸和氨基酸比对,发现油菜中一个含有RING指结构的蛋白与ATP6有相互作用,其编码区同拟南芥未命名基因AT3G47550有较高的同源性.

4　结　语

锌指蛋白是基于它的结构特征而得名,在锌指蛋白中,几个保守的氨基酸（通常为Cys与His与一个Zn结合,形成一个称为锌指的相对独立的功能区域.锌指蛋白往往具有不止一个锌指结构,它广泛分布在动植物和微生物中,从酵母到人体

常作为重要的转录调控因子参与在基因的表达调控、细胞分化、胚胎发育等许多生命过程.

而最近几年关于RING指的研究成为该领域的一个热点.

本次实验筛选得到的序列中,得到了一个651bp的含有C3HC4结构的RING指（RINGHC蛋白编码序列,下面是该序列与拟南芥未命名基因编码蛋白AT3G47550在NCBI上的氨基酸比对结果.

　　RING指是一个小的锌结合结构域,不同于普

通的锌指结构,它能通过独特的“交叉带”

（crossbrace结合两个锌原子,常见于复合蛋白质络合物的亚基.具有RING指结构的蛋白质往往同时具有与蛋白质和DNA结合的能力[11].而目前发现的具

有C3HC4结构的蛋白质大多具有泛素2蛋白质连接酶（ubiquitin2proteinligases,E3s活性.含有RING指结构域的E3s可分为几个亚类:

单亚基RINGE3s（singlesubunitRINGE3s、后期促进复合物（anaphase2promotingcomplex,APC、SCF型

529第4期岳渝飞等:

E3s和VCB2CUL2复合物（VBC.其中后三个亚类都已在植物中发现[12].泛素蛋白降解系统可以调控许多重要过程,如细胞循环、信号传导、基因转录、胞吞作用以及免疫反应、雄性不育和细胞程序化死亡等[13,14].

目前,对SCF型E3s的研究最为详尽.SCFE3s包含4个亚基:

负责与蛋白底物结合的F2box蛋白（FBP、SKP1（S2phasekinase.associatedpro2tein1,拟南芥中为ASK1、RING蛋

ROC1/HRT1和

是必需的[16].,戴良英等人利用酵母双杂交证实了ASK1与F2box蛋白COI1发生相互作用并在植物体内形成蛋白复合体,然后利用反义RNA策略进行功能分析证明了ASK1调控植物的雄性不育[17].成建红等最近在一些配子体型自交不亲和植物S2RNase基因近旁相继发现了一类花粉特异性表达的F2box基因,从而预示泛素介导的SCF蛋白降解途径可能参与配子体自交不亲和反应[18].

由于目前植物克隆的RING指蛋白还很少,还无法对其功能得到较完整的阐释.但结合RING指蛋白参与的泛素-蛋白降解途径在生物体内广泛的作用,特别是该途径在氧化压力（可能涉及ATP6相关的呼吸途径以及细胞内异常蛋白积聚（CMS导致胞内异常蛋白增多时所表现出的作用,继续就本次实验筛选出的这一基因片段做深入研究,对于揭示油菜Pol.CMS会是项很有意义的工作.

参考文献:

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