第五章生物芯片与微流控技术文档格式.docx
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随着微流控芯片技术的逐渐展开及微分析技术的需求，芯片构型设计越加丰富，出现了一系列形式各异、具有多种微通道网络结构的芯片构型。
如电泳芯片分离通道的网络形状主要有：
直线型、螺旋型、弯曲蛇形、多边形、折叠形等。
由于生化分析的复杂性和多样性需求，微流控芯片技术的发展趋于组合化和集成化，经常需在一块芯片基片上集成多种功能单元，如化学反应器、生物反应器、过滤装置等以进行多种样品的分析检测，以用于DNA测序和突变点检测，氨基酸、蛋白质、细胞检测和药物筛选等。
基于高通量快速分离的需要，多通道阵列并行操作是微流控芯片的发展趋势，芯片通道数量已从最初的12通道、96通道，发展到384通道。
4.2微流控芯片的制备
微流控芯片通过微细加工技术集成各种不同功能的单元，如微反应池、微泵、微阀、检测单元等。
微通道加工技术与以硅材料二维和浅深度加工为主的集成电路芯片不同。
微流控芯片微通道的两个重要指标是深宽比和微通道界面形状。
深宽比指在基片上形成的微结构的深度特征与宽度特征之比，高深宽比结构加工难度较大。
对于直接加工法，形状特征与腐蚀的方向性有关，即各向同性或各向异性会形成不同的几何形貌特征；
对于复制加工方法，如热模压和模塑法等，微通道几何形状直接与模板形状及加工工艺有关[5,6]。
4.2.1微流控芯片的材料
微流控芯片结构设计的首要问题是选取芯片材料，选取材料时考虑的主要因素是：
①优良的加工性能，便于大批量生产以降低费用。
材料具备良好的加工性能是提高成品率和自动化生产的前提，也是芯片批量生产的前提条件；
②生物相容性或化学惰性，不影响分析试剂、药物的化学性质；
③散热和绝缘性；
④良好的光透性能，适应光学检测的要求。
另外还要考虑材料的电渗流特性、表面可修饰性及可密封性能等。
在实际操作中，一般根据使用要求有所取舍，但材料应有良好的工艺性以便于未来产品开发。
到目前为止，制作微流控芯片的材料主要有：
硅、玻璃、石英、高聚物、陶瓷、纸等。
选择合适的材料对于制作工艺选择和微流控芯片的成功应用非常重要。
1.硅材料
单晶硅是最先尝试使用的芯片基材。
硅及二氧化硅具有良好的化学惰性和热稳定性，而且硅的微细加工技术已趋成熟。
即使复杂的三维结构，也可用整体和表面微加工技术进行高精度的复制。
硅材料的缺点在于易碎、成本高、不透光、电绝缘性差且表面化学行为复杂等，虽然较厚的氧化层（>
15μm）可以提高其绝缘层，但厚氧化层尚无成熟的键合方法。
上述缺点限制了硅材料在微流控芯片中的广泛应用。
但由于硅和聚合物材料间的粘附系数小，故现常用来制作聚合物微通道芯片时所用到的模具。
2.玻璃
玻璃和石英弥补了单晶硅在电学和光学方面的不足，价廉、易得，具有良好的电渗性和良好的光学性质，为微系统的故障诊断和光学检测提供了便利条件；
润湿能力、表面吸附和表面反应性等有利于使用不同的化学方法对其进行表面改性；
耐腐蚀性也可满足大多应用的需要。
玻璃的微细加工工艺较为成熟，能够满足一般应用需要。
由于表面性质与毛细管电泳中的毛细管材料性质基本相同，很多积累的经验和技术可以方便地移植到芯片上来。
在发展初期，这一技术极大地促进了微流控芯片的发展。
然而，玻璃和石英微流控芯片存在着制作工艺复杂，加工成本过高，而且使用玻璃和石英作基体材料时，通常使用各向同性腐蚀技术，很难获得高深宽比的微结构，深度刻蚀困难，键合温度高和键合成品率低，使芯片性能难以改善，且需要相应的洁净条件和制作设备，工艺过程复杂。
玻璃要加工制作复杂的多层结构比较困难，步骤相对繁琐，而且要想制作对液体操控所必需的微泵和微阀是非常困难的。
这些都限制了玻璃微芯片的普及化和深度产业化。
3.高分子聚合物
与硅和玻璃相比，聚合物材料种类多、选择面广、价格便宜，具有良好的绝缘性和透光性，可施加高电场实现快速分离，成型容易、批量生产成本低，易获得高深宽比的微结构，微通道表面一般不需或仅需较少修饰，绝大部分聚合物材料对生物样品或化学样品具有相容性，更适合于一次性使用，具有广阔的应用前景，已引起国内外极大的关注。
用于制作微流控芯片的聚合物主要可分为三类：
热塑性聚合物、固化型聚合物和溶剂挥发型聚合物。
热塑性聚合物有聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚碳酸酯（PC）和聚乙烯（PE）等；
固化型聚合物有聚二甲基硅氧烷（PDMS）、环氧树脂和聚氨酯等；
溶剂挥发型聚合物有丙烯酸、橡胶和氟塑料等。
其中，常用的有PMMA和PDMS。
PMMA材料具有良好的电绝缘性，可施加高电场进行快速分离。
透光性好，成本低，成型容易，可选择多种加工方法，如模压法、注塑法、准分子激光微刻蚀加工等，现已得到了极为广泛的应用。
弹性高分子材料PDMS（又称硅橡胶），具有价格便宜，绝缘性好，无毒；
它的透光性好，能透过250nm以上的紫外光与可见光，易于检测；
成型容易，批量生产成本低等优点。
但PDMS材料制成的微结构的稳定性较差，疏水性较强，经常需要进行特别处理来进行改进。
选择聚合物做芯片材料时，应根据加工工艺、应用环境及检测方法等诸多因素和聚合物的光电、机械及化学性质选择适用的类型，并注意聚合物材料在所使用的环境下的惰性、电绝缘性、热性能和表面合适的修饰改性方法等。
一般应注意以下几个方面的问题：
①良好的加工性
不同的加工方法对聚合物的加工性有不同的要求。
例如，模压法加工时要求芯片材料具有热塑性，而模塑法用的高分子材料应具有低粘度，低固化温度，在重力作用下，可充满模具上的微通道和凹槽等处。
由于微通道的构型越来越趋于复杂，高深宽比的微通道的优点很多，所以聚合物材料应具有良好的加工性。
②良好的电绝缘性和热性能
由于微流控芯片中的液体驱动经常采用电驱动方式，而且芯片经常被用于进行电泳分离，加高压电场会产生热量，高温或局部高温都会对分离效果造成影响，所以材料应有良好的电绝缘性和热性能。
③良好的光学性质
对于荧光检测和紫外检测而言，材料必须在相应的波长范围内有良好的透光性，才能进行有效的检测。
④表面易于修饰改性
聚合物材料的表面易于进行改性，如通过紫外、等离子体、激光和化学处理等，不仅可改变电渗流，而且还可减少样品的的吸附。
⑤在使用条件下材料呈化学惰性
由于在微分析操作中经常要接触到各种试剂，需要一定抗溶剂能力和耐酸碱能力，因此，在所采用的分析条件下材料应是惰性的。
⑥根据应用场合合理选择
当制作普通微流控芯片时，可选用软化温度较低的材料，如有机玻璃或聚苯乙烯；
制作PCR与CE集成芯片时，可选用软化温度较高的材料，如聚碳酸酯或聚丙烯等。
4.陶瓷
陶瓷材料易碎、透光性不好，但耐高温，有较高的抗压强度，采用软刻蚀或激光加工可制出微通道，适于极限恶劣条件下使用，如航空、太空试验和极地考察等。
5.纸
微流控纸芯片（lab-on-paper，纸上微型实验室）是近几年发展的一种新型微流控芯片。
用纸张作为基底代替硅、玻璃、高聚物等材料，通过各种加工技术，在纸上加工出具有一定结构的亲/疏水微细通道网络及相关分析器件。
与传统的硅、玻璃、高聚物微流控芯片相比，微流控纸芯片具有如下优点：
①成本更低。
纸张来源丰富，且其价格远低于硅、玻璃/石英、甚至高聚物等材质；
可通过简单的光刻、蜡印、喷墨打印、绘图等方式制作二维纸芯片，或通过简单的折纸或多层纸片叠加的方法制作三维纸芯片，因此纸芯片制作简便，其加工成本远低于传统微流控芯片。
②分析系统更易微型化、便携化。
滤纸本身具有很强的毛细管作用，经图案化疏水性处理即能引导溶液有序流动，因此无需外置的驱动泵；
纸张薄（0.07~1mm），质地轻，且可折叠，因此易于保存和运输。
③生物相容性好。
滤纸的主要成分为纤维素，具有良好的生物相容性，可以在其表面固定酶、蛋白质和DNA等生物大分子。
④检测背景低。
纸张通常是白色，有利于在纸芯片上开展比色分析。
⑤后处理简单，无污染。
纸芯片使用完后，可通过简单安全的燃烧方法进行处理，不会对环境造成污染。
4.2.2微流控芯片的制作技术
（1）光刻和刻蚀技术
传统的用于制作半导体及集成电路芯片的光刻和刻蚀技术，是微流控芯片加工工艺中最基础的。
它是用光胶、掩膜和紫外光进行微细加工，工艺成熟，已广泛用于硅、玻璃和石英基片上制作微结构。
光刻和刻蚀技术由薄膜沉积、光刻和刻蚀三个工序组成。
复杂的微结构可通过多次重复薄膜沉积-光刻-刻蚀这三个工序来完成。
光刻前先要在干净的基片表面覆盖一层薄膜，薄膜的厚度为数埃到几十微米，这一工艺过程称之为薄膜沉积。
薄膜按性能不同可分为器件工作区的外延层，限制区域扩张的掩蔽膜，起保护、钝化和绝缘作用的绝缘介质膜，用作电极引线和器件互连的导电金属膜等。
膜材料常见有二氧化硅、氮化硅、硼磷硅玻璃、多晶硅、电导金属、光刻抗蚀胶、难熔金属等。
制造加工薄膜的主要方法有氧化、化学气相沉积、蒸发、溅射等。
在薄膜表面均匀地覆盖上一层光胶，将掩膜上微流控芯片设计图案通过曝光成像的原理转移到光胶层上的工艺过程称为光刻。
光刻技术一般有以下基本工艺过程构成：
①基片的预处理。
通过脱脂、抛光、酸洗、水洗的方法使基片表面净化，确保光刻胶与基片表面有良好的粘附。
②涂胶。
在经过处理的基片表面均匀涂覆一层粘性好、厚度适当的光刻胶。
胶膜太薄，易生成针孔，抗蚀能力差；
太厚则不易彻底显影，同时会降低分辨率。
光刻胶的实际厚度与它的粘度有关，并与甩胶机的旋转速度的平方根成反比。
涂胶方法有旋转涂覆法、刷涂法、浸渍法、喷涂法等。
③前烘。
在一定的温度下，使光刻胶液中溶剂挥发，增强光刻胶与基片粘附以及胶膜的耐磨性。
前烘的温度和时间由光致抗蚀剂的种类和厚度决定，常采用电热恒温箱、热空气或红外热源。
前烘温度和时间要合适，若温度过高或时间过长会造成显影时留下底膜或感光灵敏度下降，腐蚀时出现小岛；
若温度过低或时间过短，会造成显影后针孔增加，或产生浮胶、图形变形等现象。
④曝光。
将已制备好所需芯片图形的光刻掩膜覆盖在基片上，用紫外线等透过掩膜对光刻胶进行选择性照射。
受光照射的光刻胶发生化学反应。
在实际操作中，曝光时间由光刻膜、胶膜厚度、光源强度以及光源与基片间距决定。
曝光的方式有化学曝光、接触式和接近式复印曝光、光学投影成像曝光。
⑤显影。
用光胶配套显影液通过化学方法除去经曝光的光胶（正光胶）或未经曝光的光胶（负光胶），显影液和显影时间的选择对显影效果的影响很大。
选择显影液的原则是，对需要去除的那部分胶膜溶解度大、溶解速度快，对需要保留的那部分溶解度小。
显影时间视光致抗蚀剂的种类、胶膜厚度、显影液种类、显影温度和操作方法而异。
⑥坚膜。
将显影后的基片进行清洗后在一定温度下烘烤，以彻底除去显影后残留于胶膜中的溶剂或水分，使胶膜与基片紧密粘附，防止胶层脱落，并增强胶膜本身的抗蚀能力。
坚膜的温度和时间要合适。
刻蚀是将光胶层上的平面二维图形转移到薄膜上并进而在基片上加工成一定深度微结构的工艺。
选用适当的刻蚀剂，使它对光胶、薄膜和基片材料的腐蚀速度不同，可以在薄膜或基片上产生所需的微结构。
根据刻蚀剂状态不同，可将腐蚀工艺分为湿法刻蚀和干法刻蚀两大类。
湿法刻蚀是通过化学刻蚀液和被刻蚀物质间的化学反应将被刻蚀物质剥离下来的刻蚀方法。
大多数湿法刻蚀是不容易控制的各向同性腐蚀。
其特点是选择比高、均匀性好、对硅片损伤少，几乎适用于所有的金属、玻璃、塑料等材料。
缺点是图形保真度不强，横向腐蚀的同时，往往会出现侧向钻蚀，以致刻蚀图形的最少线宽受到限制。
干法刻蚀指利用高能束与表面薄膜反应，形成挥发性物质，或直接轰击薄膜表面使之被腐蚀的工艺。
其最大的特点是能实现各向异性刻蚀，即在纵向的刻蚀速率远大于横向刻蚀的速率，从而保证细小图形转移后的保真性。
干法刻蚀的作用基础是等离子体。
用光刻的方法加工微流控芯片时，必须首先制造光刻掩模。
掩膜的基本功能是基片受到光束照射时，在图形区和非图形区产生不同的光吸收和透过能力。
对掩模有如下要求：
①掩模的图形区和非图形区对光线的吸收或透射的反差要尽量大；
②掩模的缺陷如针孔、断条、桥连、脏点和线条的凹凸等要尽量少；
③掩模的图形精度要高。
通常用于大规模集成电路的光刻掩模材料有涂有光胶的镀铬玻璃板或石英板。
用计算机制图系统将掩模图形转化为数据文件，再通过专用接口电路控制图形发生器中的曝光光源、可变光阑、工作台和镜头，在掩模材料上刻出所需的图形。
或用微机通过CAD软件将设计微通道的结构图转化为图像文件后，用高分辨率的打印机将图像打印到透明薄膜上。
此透明薄膜可作为光刻用的掩模,基本能满足微流控芯片对掩模的要求。
（2）热压法
热压法（hotembossing）是一种应用较广泛的快速复制电泳微通道的芯片制作技术，适用于PMMA与PC等热塑性聚合物材料。
热压法的模具可以是直径在50μm以下的金属丝或是刻蚀有凸突的微通道骨片阳膜，如镍基阳模、单晶硅阳模、玻璃阳模、微机械加工的金属阳模。
在热压装置中将聚合物基片加热到软化温度，通过在模具上施加一定的压力，保持30~60s，可在聚合物基片上压制出与模具凹凸互补的微通道。
此法可大批量复制，设备简单，操作简便，但所用材料有限。
（3）模塑法
用光刻和刻蚀的方法先制出阳模（所需通道部分突起），浇注液态的高分子材料，然后将固化后的高分子材料与阳模剥离，得到具有微通道芯片的这种制备微芯片的方法称为模塑法。
模塑法的关键在于模具和高分子材料的选择，理想的材料应相互之间粘附力小，易于脱模。
微通道的阳膜可由硅材料、玻璃、环氧基SU-8负光胶和PDMS等制造。
硅或玻璃阳膜可采用标准刻蚀技术。
PDMS模具可通过直接浇注于由硅材料、玻璃等材料制的母模上制得。
通过光刻可在SU-8负光胶上得到高深宽比（20:
1）和分辩率高达几微米的图形，经显影烘干后可直接作模具用。
浇注用的高分子材料应具有低粘度，低固化温度。
在重力作用下，可充满模子上的微通道和凹槽等处。
可用的材料有两类：
固化型聚合物和溶剂挥发型聚合物。
固化型聚合物有PDMS、环氧树脂和聚氨酯等，与固化剂混合，固化变硬后得到微流控芯片；
溶剂挥发型聚合物有丙烯酸、橡胶和氟塑料等，溶剂缓慢挥发而得到芯片。
虽然模塑法受限于高分子材料，但该法简便易行，芯片可大批量复制，且不需要昂贵的设备，是一个可以制作廉价分析芯片的方法。
（4）注塑法
注塑法的工艺是通过光刻和刻蚀技术在硅片上刻蚀出电泳芯片阴模，用此阴模进行24h左右的电铸，得到0.5cm厚的镍合金模，再将镍合金模加厚，精心加工制成金属注塑模具，将此模具安装在注塑机上批量生产聚合物微流控芯片基片。
在注塑法制作过程中，模具制作复杂，技术要求高，周期长，是整个工艺过程中的关键步骤。
一个好的模具可生产30~50万张聚合物芯片，重复性好，生产周期短，成本低廉，适宜于已成型的芯片生产。
（5）LIGA技术
LIGA是德文Lithographie，Galvanoformung，Abformung三个字的字头缩写。
LIGA技术是由光刻、电铸和塑铸三个环节组成。
第一步为同步辐射深度X光曝光，可将掩膜上的图形转移到有几百微米厚的光刻胶上，得到一个与掩膜结构相同、厚度几百微米、最小宽度为几微米的三维立体结构。
电铸可采用电镀的方法，用光刻胶下面的金属进行电镀，将光刻胶图形上的间隙用金属填充，形成一个与光刻胶图形凹凸互补的金属凹凸版图，将光刻胶及附着的基底材料除掉，得到铸塑用的金属模具。
通过金属注塑版上的小孔将塑料注入金属模具腔体内，加压硬化后得到与掩膜结构相同的芯片。
热塑性高分子材料，如聚酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚偏二氟乙烯都可以通过注塑的方法复制微流控芯片。
LIGA技术已用于高深宽比的聚合物芯片制作，也可用于加工微电机、微泵、微阀等三位微器件。
准LIGA技术是用紫外光光源来代替LIGA技术中的同步辐射X光深层光刻，然后进行后续的微电铸和微复制工艺。
它不需要同步辐射X光光刻和特制的X光掩膜板，有利于实现微机械器件的大批量生产。
根据紫外光深层光刻的工艺路线的不同，准LIGA技术又可分为多层光刻—LIGA、硅模深刻蚀—LIGA和SU-8深层光刻—LIGA三类。
（6）激光烧蚀法
激光烧蚀法是一种非接触式的微细加工技术。
它可直接根据计算机CAD的数据在金属、塑料、陶瓷等材料上加工复杂的微结构，已应用于微模和微通道的加工。
用紫外激光使可降解高分子材料曝光，把底片上的二维几何图形精确复制下来。
调整曝光强度可控制材料的光解深度。
用压力吹扫去除降解产物，得到带有微通道的基片。
所得微流控芯片结构具有受热破坏小、通道壁垂直、深宽比大等特点。
通常，可根据烧蚀对象选择激光的脉冲强度和脉冲数。
该法可应用于制备聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、醋酸纤维素、聚对苯二甲酸乙二醇酯和聚四氟乙烯等高分子材料芯片。
这种方法对技术设备要求较高，步骤简便，而且不需超净环境，精度高。
但由于紫外激光能量大，有一定的危险，需在标准激光实验室中进行操作，使用安全保护装备和防护眼镜。
（7）软光刻
软光刻（softlithography）是相对于微制造领域中占据主导地位的光刻而言的微图形转移和微制造的新方法，以自组装单分子层、弹性印章和高聚物模塑技术为基础，由哈佛大学Whitesides教授研究组为主的多个研究集体提出的低成本的微细加工新技术。
它能制造复杂的三维结构及不规则曲面；
能应用于生物高分子、胶体、玻璃、陶瓷等多种材料；
没有相关散射带来的精度限制，可以达到30nm~1μm级的微小尺寸；
所需设备简单，在普通实验室环境下能应用，无须特别苛刻的微加工条件和实验条件，一次制成的模板可以多次重复使用，极大地缩短了芯片制作所需的时间，加快研究速度，降低芯片制作的难度和成本。
因此软光刻是一种便宜、方便，适于实验室使用的技术。
软光刻技术的核心是弹性模印章，可通过光刻蚀和模塑的方法制得。
PDMS是软光刻中最常用的弹性模印章。
软光刻的关键技术主要包括微接触印刷、再铸模、微传递成模、毛细管成模、溶剂辅助成模等。
微接触印刷是指用弹性印章结合自组装单分子层技术在平面或曲面基片上印刷图形的技术。
已确定的自组装单分子层体系有烷基硫醇在金银等金属表面和烷基硅氧烷在玻璃、硅、二氧化硅表面等体系。
微接触印刷过程非常简单。
用一种弹性体PDMS印模通过接触来传递“墨水”上的分子到底物表面。
印刷之后，通过含有第二种分子的稀释液来冲洗基底，从而在该图案的非衍生区生成不同的自组装单分子层。
软光刻再铸模通常是指用弹性模而不是用刚性模来重新铸模。
PDMS的弹性和低表面能有利于弹性模的剥离。
在PDMS上再铸模时，可通过机械压制、绑缚、拉紧或以上几种应变的结合，获得比原始印模更小的纳米尺寸。
基于再铸模的方法可制作30nm的有机聚合物结构，其垂直精度达±
3nm。
微传递成模是在PDMS模具表面滴入预聚合物液体，用扁平的PDMS块刮削或用氮气吹去过多的液体。
盛满液体的PDMS模在辐射或高温条件下与底物接触，液体干燥后，小心移去弹性模，在底物表面得到聚合物微结构。
微传递成模能够同时产生单独又相互联系的微结构，最为突出的优点是其可方便地在不平滑表面生成微结构，或生成较大面积的微结构，也可一层层地叠加建立三维结构。
毛细管成模时将PDMS模置于基底上并与基底表面良好接触，形成一个中空的通道网络，将低粘度的液态预聚合物置于开放的网络通道一端，由于毛细作用，预聚物会自发地逐渐充满整个毛细管网络，干燥后取下PDMS模得到所需的聚合物微结构。
溶剂辅助成模是在聚合物基底上制作准三维结构的一种软光刻方法，兼有再铸模和压膜的特点。
这种方法的关键是选择一种能溶解聚合物基底却不使PDMS印模溶胀的溶剂。
通常这种溶剂要有较高的蒸汽压和表面张力，确保多余溶剂较快蒸发，减小PDMS模的膨胀。
软光刻技术还存在着一些缺陷，如PDMS固化后有1%的收缩变形，而且在甲苯和乙烷的作用下，深宽比将出现一定的膨胀；
PDMS的弹性和热膨胀性使其很难获得高的准确性，也使软光刻在多层面的微加工中受到限制；
由于弹性模太软，无法获得大的深宽比，太大或太小的宽深比都将导致微结构的变形或扭曲。
2000年,加州理工学院Quake等提出了一种基于PDMS材料的多层软蚀刻技术（multilayersoftlithography）制作新型的气动微阀和微泵的概念。
研究组正式应用气动微阀技术以“大规模集成微流控芯片”为题在美国《科学》杂志上发表文章，介绍集成了上千个微阀和反应器的微流控芯片，标志着芯片从简单的电泳分离到大规模集成化的技术飞跃[7,8]。
如今微流控芯片已经成为涵盖了从分离分析、化学合成、医学诊断学、细胞生物学、神经生物学、系统生物学、结构生物学、微生物学等一系列应用研究领域的综合性交叉学科。
第五节微流控芯片单元
高密度集成的微流控芯片装置可以实现高通量并行化的实验以及多种操作单元的功能一体化，作为一种新的方法学平台，已经越来越多地应用于化学和生命科学的研究中。
单元操作主要包括进样、样品处理、混合、反应及分离等[30]。
5.1进样及样品前处理单元
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