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学习氧瓶燃烧法的原理及操作技术。

1、燃烧瓶的使用

2、样品测定

实验五硫酸阿托品注射液的含量测定

（酸性染料比色法）

掌握酸性染料比色法测定生物碱制剂的基本原理及操作方法。

1、对照液的制备

2、供试液的制备

1、测定法

实验六高效液相色谱法测定血清茶碱浓度

一、目的要求:

掌握离效液相色谱法测定血清茶碱样品制备标准曲线的基本方法及测定前样品的制备处理基本操作方法。

二、教学内容

1、样品的提取

2、标准曲线的绘制

实验七复方乙酰水杨酸片的含量测定

掌握复方制剂中各成分的分离及含量测定的基本原理和操作方法。

1、乙酰水杨酸得含量测定：

2、咖非因的含量测定：

实验四：

（原待定）紫外分光光度法测定异烟肼片剂含量

本实验为设计性实验，使同学自己根据所学知识设计实验方案，然后进行实验操作，完成用紫外分光光度法测定异烟肼片剂含量

1、同学根据所学有关专业知识按照中国药典的格式自己设计用紫外分光光度法测定异烟肼片剂含量实验方案和操作方法（设计两种方法）及应准备用的仪器、试药、试剂。

实验讲义

一、教学目的：

二、实验内容：

取本品0.6g，加水溶解使成25ml，再加稀硝酸10ml，溶液若不澄清、滤过，置50ml纳氏比色管中，加水使成40ml，加硝酸银试液1ml，用水稀释至50ml，摇匀在暗处放置5分钟，如发生混浊，与标准氯化钠6ml同法操作所制的对照液比较，不得更深（0.01%）。

2．硫酸盐的限量检查

取本品2g，加水溶解使成40ml，溶液若不澄清、滤过，置50ml纳氏比色管中，加稀HCl2ml，摇匀，加25%氯化钡溶液5ml，用水稀释成50ml，摇匀，放置10分钟，如发生混浊，与标准硫酸钾溶液2ml同法操作所制的对照液比较，不得更深（0.01%）。

3．重金属的限量检查

取本品4g，加水23ml溶解，再加稀醋酸2ml，加硫化氢试液10ml，摇匀在暗处放置10分钟，与标准铅溶液2ml同法操作所制的对照液比较，不得更深（5ppm）。

4．铁盐的限量检查

取本品2g，加水20ml溶解，再加硝酸3滴，缓缓煮沸5分钟，用水稀释至45ml，加硫氰酸铵溶液（3→100）3ml摇匀，如显色，与标准铁溶液2ml同法操作所制的对照液比较，不得更深（0.001%）。

演示。

思考题

1．在进行氯化物检查、硫酸盐或重金属检查时，遇到有颜色的样品如何处理？

2．重金属检查有几种方法？

本实验采用何种方法？

该法的最适pH为多少？

3．何谓“限度检查”？

杂质限度应如何计算？

（1）

一、目的要求：

二、提要

1.特殊杂质是指药物本身特有的根据其生产主艺、自身牲质，而产生的杂质,其检查方法在药典中列在各药品的检查项下。

2.特殊杂质的检查方法是根据药物与杂质在理化性质及生物活性上的差异，选择灵敏变高，专属性强的方法做为检查方法,如根据其对光的选择性差异，可选用比色法〈目视、可见、紫外）及原子吸收分光光度法，根据理化学性质上的差异,可选薄层层折法，气相色谱法，高压液相法等。

3.乙酰水杨酸中游离水杨酸（生产中未反应完全或贮存中水解产生的）的检查，采用目视比色法。

4.盐酸普鲁卡因发生如下分解反应

普鲁卡因对氨基苯甲酸

利用盐酸普鲁卡因和对氨基苯甲酸在硅胶G簿极上吸附行为不同,经层析而达到分离的目的。

以一定限量的对氨基苯甲酸对照品为标准进行杂质限量，利用对二甲氨基苯甲醛进行显色。

三、实验内容：

1.乙酰水杨酸中游离水杨酸检查

取本品0.lg加乙醇1ml溶解后，加冷水至50ml,立即加新制的硫酸铁铵溶液1ml摇匀30秒钟内如显色,与对照液〈精密称取取水杨酸0.1g加水溶解后，加冰醋酸1ml,摇匀,再加水使成1000ml摇匀，〉精密量取1ml，加乙醇1ml，加冷水至50ml,立即加新制的硫酸铁铵溶液1ml摇匀，比较不得更深。

标准对氨基苯甲酸的制备：

精密称对氨基苯甲酸对照品，加乙醇制成每ml含30ug的溶液。

供试液的制备：

精密量取盐酸普鲁卡因注射液加乙醇制成每ml含2.5mg的盐酸普鲁卡因溶液。

（2）

薄板的制备：

取层析用硅胶G粉约2.5g，加适量水〈约按1:

2；

1:

3〉调匀，研磨、铺在平滑玻璃板上〈一般厚度0.2~0.3mm阴干,105C加热活化1小时取出放入密闭干燥器内备用

点样：

在制好的薄板上距下端边2.5cm处,用微量注射器分别吸取对照液和在试液各lOul分别点样两点间一般距离1.5~2.0cm，距边缘一侧1.5~2.5cm。

展开：

用丙酮:

0.8%盐酸〈9;

1）混合液作展开剂,10~15ml展开剂于层析槽中,将点好样的薄板放入饱和5分钟,用倾斜上行法展开,展开长度为10~15cm取出后风干。

显色：

用喷雾器啧射显色剂对二-甲氨基苯醛溶被使其显色〈2%对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液looml加5ml冰醋酸〉。

供试溶液如显与对照品相应的杂质斑点与对照品溶液的主斑点比较不得更深。

四、注意事项

1·

游离水杨酸检查中,样品管应尽量干燥，不得带λ过多的水,否则样品加醇后不易溶解。

2.薄板所用的玻璃必须仔细清洗,不附着油污，否则易引起薄层的剥落。

3·

用石膏作粘合剂时,此法的关键是控制开始凝固的时间,过早倒于玻板上则易流,过迟则太粘不能成均匀薄层。

4·

如在空气中点样一般不超过10分钟,所点圆点直径应小于3mm并应分次点,以免使圆点扩大，直径太大，所有圆点在统一水平线上,面积也应尽可能一致。

思考题:

1.乙酰水杨酸中游离水杨酸检查中,为何要在30秒钟内比色?

2.盐酸普鲁卡因注射液中对氨基苯甲酸杂质限量是多少?

3.TLC杂质检查有儿种类型?

4.举例哪一种杂质检查是通过反应灵敏度来控制的?

（3）

盐酸普鲁卡因含有芳伯氨基，在酸性条件下与亚硝酸钠发生重氮化反应。

外指示剂法：

精密量取本品适量（约相当于盐酸普鲁卡因0.1g）加水40ml与（1→2）盐酸液15ml，而后置电磁搅拌器上，搅拌使混合均匀，再加溴化钾2g，插入铂电极后，将滴定管插入液面下约2/3处，在15～20℃用0.05mol/L亚硝酸钠在搅拌下迅速滴定。

，在近终点时将滴定管的尖端提出液面上用少量水将尖端洗涤，洗液并入溶液中，继续缓慢滴定，至用细玻棒蘸取溶液少许，划过涂有含锌碘化钾淀粉糊的瓷板上，即显兰色条痕时，停止滴定，3分钟后再蘸取少量划过一次，如仍显兰色条痕时，即为终点。

1ml亚硝酸钠液（0.05mol/L）相当于13.64mgC13H20N2O2.HCl

思考题：

1、加入KBr的目的？

2、重氮化法的影响因素是什么？

3、开始滴定时，滴定管为什么要插入液面，不插入是否可以？

4、写出标示量%的计算公式。

（4）

紫外分光光度法测定异烟肼片剂含量

指导思想：

为提高对理论知识的深入理解和综合利用的能力，提高理论与实验结合的能力，提高自学能力，适应将来实际参加工作能力，安排一定的设计性试验，要求同学根据所学有关专业知识并查阅相关文献，自己设计药品质控标准的一些实验方法，及应准备用的仪器、试药、试剂。

教师课堂给与点评，并指导同学按正确方法完成实验。

一、实验目的：

二、实验要求：

1、同学根据所学有关专业知识按照中国药典的格式自己设计用紫外分光光度法测定异烟肼片剂含量实验方案和操作方法（设计两种方法）及应准备用的仪器、试药、试剂。

2、写出预习报告。

包括实验目的，原理，实验应用的仪器、试药试剂，操作步骤，计算公式，及实验操作中应注意的问题。

然后经教师指导进行实验，写出实验报告。

3、异烟肼片标示量（或规格）：

50mg，或100mg

三、参考文献：

中国药典（2000，1995，1990年版；

）教科书，有关药学专业期刊文献

（5）

原试验四氟尿嘧啶的含量测定

1.燃烧瓶的使用

燃烧瓶系取500ml碘瓶一个，在瓶塞底部熔封一根铂丝，下端弯成夹状或螺旋状，长度约为瓶身长度的2/3。

将称取的供试品置于无灰滤纸的中心，按虚线折成后，固定于铂丝下端的弯曲处，使尾部露出，另在燃烧瓶中加适量吸收液，并将瓶颈用水润湿，小心急速通入氧气1~2分钟（通气管应接近液面，使瓶内空气尽量排尽），立即盖住瓶口，移至防护设备中，点燃包有供试品的滤纸的尾部，迅速放入燃烧瓶，按紧瓶塞，用水封口，等燃烧完毕后（应无黑色碎片），充分震摇，使生成的烟雾完全吸入吸收液中。

然后按规定方法进行测定。

2.样品测定

取本品15mg精密称定，用氧瓶燃烧法进行破坏，以水20ml为吸收液，待生成的烟雾完全吸入吸收液后，移至100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试液。

另取105OC干燥1小时的氟化钠约25mg，精密称定换算成含氟量（）置100ml量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀。

临用前，精密量取20ml置另一100ml量瓶中加水稀释至刻度，摇匀，做对照液。

精密量取供试液与对照液各2ml，分置50ml量瓶中，各加茜素氟蓝试液10ml摇匀，再各加每100ml中含NaAc12g，与冰醋酸6ml的溶液3ml，硝酸铈液试液10ml，加水稀释至刻度摇匀，在暗处放置1hr，照分光光度法置2cm吸收池中，在610nm波长处测吸收度，并将供试液的吸收度用空白校正，计算即得。

注意事项：

1．检查氧瓶有无裂纹，氧瓶必须洗净，无有机物，瓶口湿润，铂丝要干燥。

注意安全，燃烧时用干布包裹。

2．样品固定松紧适度，以防燃烧时脱落或燃烧不完全。

3．燃烧瓶中通入氧气量要适度，少则样品燃烧不完全，太多则燃烧时易

将瓶塞冲起，一般通入1~2分钟为宜。

4．样品燃烧完毕应充分振摇至瓶中烟雾消失，为使吸收完全，再放置15分钟，并用水封口。

1．氧瓶燃烧法的成败关键是什么？

2．如何做空白？

3．氧瓶燃烧法用于测定哪类药物？

4．写出测得结果的F%计算公式？

（6）

1．对照液的制备

精密称取在120OC干燥至恒重的硫酸阿托品对照品25mg至25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，至100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml含无水硫酸阿托品50ug）。

2．供试液的制备

精密量取本品适量（约相当硫酸阿托品2．5mg）至50ml量瓶中，加水稀释至刻度摇匀即得。

3．测定法

精密量取对照液与供试液各2ml，分别置于预先精密加入氯仿10ml的60ml分液漏斗中，各加溴甲酚绿溶液2ml，摇匀提取2分钟后，静置分层，分取氯仿层移置1cm吸收池中，以水2ml按同法操作所得的氯仿液作空白，在420nm的波长处分别测定吸收度。

三、注意事项：

1．本实验所用分液漏斗必须干燥无水

2．供试品和对照品平行操作，提取振摇，放置时间等均应一致。

3．用甘油淀粉糊均匀地涂在分液漏斗磨口处。

4．分取氯仿层测定时，初流液应弃去，所取氯仿层必须澄清、透明、不混有水珠。

5．初次振摇，要放气。

四、思考题

1．酸性染料比色法测定生物碱的原理是什么？

2．如何选择酸性染料，提取溶剂？

3．为何要求标准品与供试品同时操作，振摇和放置时间应一致

4．写出标示量百分含量的计算公式？

二、原理:

以β-羟乙基茶碱为内标,用氯仿/异丙醇（95/5.V/V）的混合液提取血清样品中的茶碱,将提取液蒸干后用甲醇复溶,进行色谱分析,用波长254nm检测分析物的含量。

三、仪器与试剂:

（1）.仪器:

高效液相色谱仪,微量进样器。

（2）.试药与配制:

β-羟乙基茶碱与茶碱标准品,乙睛、甲醇、氯仿、异丙醇、无水乙醇（均为分析纯）,去离子重蒸水。

配制标准茶碱贮备液:

浓度为1mg/ml的茶碱乙醇溶液。

配制内标乙醇应用液:

浓度为0.2mg/ml的β-羟乙基茶碱乙醇液。

配制血清茶碱标准应用液:

用无药血清配制茶碱浓度分别为5.0,10.0,20.0,和40.0μg/m1的血清标准液,可先配成40.0μg/ml的茶碱血清标准液.密

（7）

封于-20℃冰箱保存,用时以无药血清稀释至所需浓度。

配制提取液,于95ml氯仿中加入异丙醇5ml。

（3）色谱条件:

反相C18色谱柱,内填无定型十八烷烧基硅烷;

流速15ml/mim检测波长254nm。

四、操作步骤:

①取具塞离心试管七只,分别精密加入无药血清,血清标准应用液（分别含茶碱浓度为5·

0,10·

0,20·

0,及40.oμg/ml）,质控血清及待测血清各100μl。

②分别精密加入内标乙醇应用液10μl。

③各试管分别精密加入提取液1·

5m1。

④将各离心试管置旋涡振荡辘振荡半分钟,不要连续振荡,应半分钟内间断5-6次,防止乳化不易分离。

⑤振荡后离心3分钟（2000转/分）。

⑥用尖细吸管吸去上层水相。

⑦小心将下层有机相吸取1ml置另一洁净试管,切勿带入水相。

⑧在通风柜内氮气60℃水浴蒸干。

9·

用甲醇50μl重溶残留物用微量进样器吸取10μl进样进行色谱分析。

（5）结果计算:

分别测量出标准茶碱应用液的茶碱及内标的峰高比或峰丽积比,以浓度为横座标,以峰高比或峰面积比为纵座标,回归标准曲线方程（或做标准曲线）o测量出质控样品及待测样品中茶碱及内标的峰高比或峰面积比,分别代入标准曲线,计算样品中茶碱的浓度。

实验七复方乙酰水杨酸片的含量测定

一．目的要求：

二．提要：

1．复方乙酰水杨酸片的处方

乙酰水杨酸230g

扑热息痛126g

咖啡因30g

辅料适量

制成1000片

2．①乙酰水杨酸采用提取容量法：

以氯仿提取后蒸干，溶于中性醇，

以氢氧化钠测定。

②咖啡因采用剩余碘量法。

以B代表咖啡因，

2B+4I2（定过量）+2KI+H2SO4→2（B.HI.I4）↓+K2SO4

I2（过量）+2Na2S2O3→2NaI+Na2S4O6

三．实验内容：

1.取本品20片，精密称定，研细备用。

水浴蒸干氯仿时间不宜过长。

精密量取上述细粉适量（约相当于乙酰水杨酸0.4克）,置分液漏斗中,加水15ml,摇匀,用氯仿振摇提取4次（20、10、10、10ml）氯仿液用同一份水10ml洗涤合并氯仿液，置水浴上蒸

（8）

干，残渣加中性乙醇（对酚酞指示剂呈中性）20ml溶液中，加酚酞指示剂液3滴用0.1mol/L氢氧化钠液滴定，即得（每1ml0.1mol/L氢氧化钠相当于18.02mgC9H8O4）。

精密称取上述细粉适量（约相当于咖啡因50mg）加稀硫酸5ml，振摇数分钟使咖非因溶解，用棉花过滤，滤液置50ml容量瓶中，滤器与滤渣用水洗涤5次，每次3ml。

合并滤液与洗液，精密加0.1mol/L碘液25ml，用水稀释至刻度，摇匀，在约25闭光放置15分钟，滤过，弃去出滤液，精密量取续滤液25ml，用0.05mol/L硫代硫酸钠液滴定,至近终点加淀粉指示剂继续滴定至兰色消失,并将滴定结果用空白试验校正即得（每1ml0.1mol/L碘液相当于5.306mg的C8H10O2N4.H2O）

四．注意事项：

2.片子应尽量研细，不应有所损失。

3.扑热息痛的水解，务必要保持微沸状态，否则水解不易完全，影响结果。

4.过滤咖啡因与碘形成的沉淀时，需用干燥的滤纸，最初的滤液应弃去10至15ml，过少可能影响碘的浓度，过滤时要防止碘液挥发。

5.测定乙酰水杨酸时，锥形瓶应干燥，滴定应迅速。

五、思考题：

1、如何配制中性醇？

2、测定咖啡因为何要做空白试验？

如何做？

3、碘浓度不准时对结果有何影响？

4、写出称量范围，计算公式，及标示量%计算公式。

5、用硫代硫酸钠滴定时加淀粉指示剂多少毫升？

（9）

药物分析实验讲义

药学院药物分析教研室

2005、3

异烟肼片含量测定

取本品10片，精密测定，研细，精密称取适量（与相当于异烟肼0.1g），置100ml量瓶中，加水适量，超声波振荡5分钟使溶解并用蒸馏水稀至刻度，摇匀，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，精密量取续滤液，1ml置另一100ml量瓶中，并用蒸馏水稀至刻度，摇匀，于263nm波长mlmlmlcm