糖尿病大鼠肾脏病变及其SnoN蛋白表达的变化Word文档下载推荐.docx

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光镜检查肾组织形态学改变。

结果：

DM组大鼠出现高血糖、高血脂、肾功能和肾组织形态学改变；

HG组血清胰岛素水平、甘油三酯和总胆固醇明显升高，血糖与NC组相比差异无统计学意义；

Western印迹检测发现DM8组肾组织中SnoN蛋白的表达明显低于NC组，且随病程进展逐渐减少，至DM16时减至NC组的64.20%。

结论：

成功复制了2型糖尿病动物模型；

SnoN蛋白的表达变化可能参与了2型糖尿病肾脏病变的发生、发展过程。

【关键词】糖尿病，非胰岛素依赖型；

糖尿病肾病；

大鼠，

Sprague-Dawley；

转录共抑制因子SnoN

[Abstract]Objective:

Toestablishtype2diabeticratmodelandobserveitsrenallesionsandSnoNproteinexpression.Methods:

Sprague-Dawleyratsweredividedintonormalcontrol,high-fatandhigh-sucrosegroups.High-fatandhigh-sucrosegroupswerethendividedintohigh-fatandhigh-sucrosecontrolsanddiabetesmellitusgroupsaftertakinghigh-fatandhigh-sucrosedietfor12weeks.Thediabeticratswereinjectedwithlowdoseofstreptozotocin（30mg/kg）andwerekilledatthe20th,24th,and28thweeksrespectively.TheSnoNproteinsinrenalcortexweredetectedwithWesternblotting.Bloodglucose,seruminsulinconcentration,trigly-ceride,totalcholesterol,serumcreatinineand24hurineproteinwereexaminedwithbiochemistrymethods.TherenalmorphologyonHEstainedsectionswascheckedwithlightmicroscope.Results:

Diabeticratsshowedhyperglycaemia,hyperlipemia,kidneymorphologicallesionandrenalfunctionchanges.High-sucrosecontrolgroupshowedhyperinsulinemiaandhyperlipemia,butthebloodglucosewasnormal.WesternblottingresultsshowedthattheexpressionofSnoNindiabeticrenaltissuessignificantlydecreased（P0.01）.Conclusions:

Ratmodelsoftype2diabetesmellitushavebeenestablishedsuccessfullywhichcanbeusedasadiabeticnephropathymodel.ThechangeofSnoNproteinexpressionmayplayaroleinthemechanismsoftype2diabeticnephropathy.

［Keywords］diabetesmellitus,non-insulin-dependent;

diabeticnephrosis;

rats,Sprague-Dawley;

transcriptionco-repressorSnoN糖尿病是严重威胁人类健康的以高血糖为特征的代谢性疾病，其中

2型糖尿病（T2DM）的发生在国外占整个糖尿病比例的85%~95%，国内报道则在90%以上［1］。

但目前国内糖尿病的研究多采用大剂量链脲佐菌素（streptozoticin,STZ）诱导的1型糖尿病模型，国外对2型糖尿病的研究亦大多采用价格昂贵的自发性动物模型，并且其特点

是遗传因素在发病过程中占主导地位，与临床上的发病特征不完全吻合。

而对于膳食加小剂量STZ注射诱导的与临床发病过程相近的2

型糖尿病模型的复制方法，目前尚无统一的标准［2］。

引起糖尿病患者死亡的主要原因是其血管并发症，而糖尿病肾病即是其常见的微血管并发症之一。

以往的研究发现核转录共抑制因子SnoN蛋白的表达变

化与STZ诱导的糖尿病大鼠肾病的发生、发展过程密切相关［3］。

2007年8月~2008年8月采用高脂、高糖饮食加小剂量STZ腹腔注射的

方法，通过调整饮食结构和饲喂时间探讨2型糖尿病模型的复制，并对其发病过程中肾脏病变及SnoN蛋白的表达变化进行观察。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1动物和试剂Sprague-Dawley（SD）大鼠30只，雄性，体重（200±

20）g,由贵阳医学院实验动物中心提供。

STZ购于美国

Sigma公司；

SnoN抗体购于美国SantaCruz公司；

B-actin单克隆抗体及DAB显色剂和辣根过氧化物酶标记的二抗购于武汉Boster公

司；

Western印迹用PVDF膜，3mmWhatman滤纸购于美国milli-pore公司；

胆固醇购于北京双旋微生物培养基制品厂；

胰岛素测定试剂盒购自天津九鼎生物医学工程有限公司；

TG和TC测定试

剂盒购自四川迈克有限公司；

考马斯亮蓝测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.1.2主要器材日本京都血糖仪；

高速低温离心机（美国Beckman公司）；

核酸蛋白分析仪（美国Amersham公司）；

电泳系统及电转移装置（美国Amersham公司）；

凝胶成像系统（美国Bio-RAD公司）。

1.2方法

1.2.1动物分组将SD大鼠随机分成正常对照组（NC,n=6）、高脂高糖组（HG,n=24）。

高脂高糖组喂养12周后又随机分为高脂高糖对照组（HC,n=6）、糖尿病组（DM,n=18）。

成模大鼠随机分别于糖尿病8周（DM8,n=6）、12周（DM12,n=6）和16周（DM16,n=6）处死。

NC组以常规饲料喂养，各组大鼠均自由饮水。

1.2.2饮食诱导胰岛素水平升高大鼠适应性饲养1周后，HG组以高脂、高糖饲料喂养，饲料组成如下：

67%常规饲料、20%蔗糖、10%猪油、2%胆固醇、1%蛋黄。

喂养12周时，称体重，测空腹血糖，尾动脉取血测血清胰岛素水平。

123小剂量STZ注射诱导糖尿病高脂、高糖饮食12周后,DM组大鼠按30mg/kg剂量腹腔注射STZ（以pH4.5、0.01mol/L无菌枸橼酸缓冲液配成1%浓度）。

72h后测空腹血糖，血糖值＞13.8mmol/L者作为2型糖尿病大鼠，18只大鼠全部建模成功。

1.2.4动物标本的采集分别于试验的第20周、24周和28周时处死DM8、DM12和DM16各组大鼠，于28周时一并处死NC和HC组大鼠。

处死前代谢笼留24h尿液，称体重，股动脉取血；

开腹取肾脏，称肾重，一侧肾脏固定于4%多聚甲醛，另一肾脏于-80C保存供Western印迹检测。

1.2.5生化检测氧化酶（GOD-PAP）法测血清葡萄糖；

放免法测血清胰岛素水平；

考马斯亮蓝法测尿蛋白浓度，尿蛋白浓度与24h

尿量的乘积为24h尿蛋白量；

血甘油三酯和胆固醇测定均按试剂说明书操作。

1.2.6肾组织形态学观察多聚甲醛固定的肾脏组织行石蜡切片，经HE染色后光镜观察肾组织形态学改变。

1.2.7Western印迹检测取-80C保存的各组大鼠肾皮质，每组

100mg，分别加入组织蛋白提取液后匀浆、离心、取上清，考马斯亮蓝法测定各组蛋白质浓度，每个样品上样150⑷，按所测得浓度

计算各样品所需体积，加入2倍上样缓冲液煮沸10min。

经12%的

SDS-PAGE凝胶电泳分离，再转移至PVDF膜上，脱脂奶粉室温封

闭1h，加入SnoN或B-actin—抗，工作浓度均为1100,4C孵育过夜。

复温45min，TBST洗膜后，加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗（浓度均为15000）室温孵育2h，加DAB显色液显色。

凝胶成像系统进行图像分析，用Quantityone软件分析蛋白条带，测定各条带的面积和灰度值，二者乘积为积分灰度值，以SnoN与B

-actin的积分灰度值比值为SnoN蛋白相对值，取3次重复测定值之均数。

1.2.8数据分析所有数据以x±

s表示，采用SPSS11.5软件处理，两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。

2结果

2.1高脂、高糖饮食对各组大鼠体重、血糖及血清胰岛素的影响

高脂、高糖饮食12周时，与NC组相比，HG组大鼠体重及血清胰岛素水平显著增加（P0.01）;

空腹血糖与NC组相比差异无显著性

（P0.05），见表1。

表1饮食对各组大鼠体重、血糖及胰岛素的影

响

（1）与正常对照组相比，P0.01

2.2小剂量STZ注射后对各组大鼠血糖、血清胰岛素、血清甘油三酯及胆固醇的影响

注射STZ后&

12及16周，DM各组空腹血糖均明显高于未注射的28周的NC组和HC组，差异有显著性（P0.01）;

血清胰岛素较注射STZ前明显下降且显著低于HC组（P0.01），但与NC组相比差异无显著性。

DM组各组血清甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）均显著高于NC组（P0.01），且随病程进展而升高，至DM12和DM16时显著高于HC组（P0.01）。

见表2。

2.3血肌酐、24h尿蛋白及肾脏指数

大鼠在注射STZ后8周，血肌酐（Scr）、24h尿蛋白（24hurineprotein,24UP）及肾脏指数（kidneyindex,KI）均显著高于NC组和HC组（P0.01），且随病程进展逐渐升高。

HC组与NC组相比血肌酐、24h尿蛋白及肾脏指数差异均无显著性，见表3。

2.4肾组织形态学变化

HE染色下见正常组肾小球形态完整、轮廓清晰；

肾小管未见异常。

DM16组肾小球体积增大和表2不同时点糖尿病组的血糖、胰岛素、甘油三脂及胆固醇表3各组大鼠血肌酐、24h尿蛋白及肾脏指数的变化系膜基质增生；

肾小管管腔扩张，上皮细胞脱落，部分肾小管基底膜不完整，间质可见炎细胞浸润。

见图1。

2.5Western免疫印迹结果

NC组和HC组大鼠SnoN表达较多，SnoN与p-actin的积分灰度值之比分别为0.81±

）.06和0.94±

0.16，两组间差异无统计学意义。

DM8组为0.63±

0.05，与NC组相比显著减少，随着DM的进展SnoN的表达逐渐减弱，至DM16组时减少为正常组的64.20%（0.52±

0.11）。

见图2。

3讨论

2型糖尿病是由于胰岛素抵抗和胰岛素分泌障碍两方面缺陷引起

的。

其中胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要始发因素，贯穿于2型糖尿病的发生、发展整个过程。

胰岛素抵抗发生后，只要胰腺能维持足够

的胰岛素分泌量来克服胰岛素抵抗，那么糖耐量将保持正常或只有轻微受损。

而一旦B细胞功能开始下降，糖耐量将迅速降低，并发展成糖尿病。

目前，国内外2型糖尿病模型的复制多数即根据此原理，先通过高脂、高糖饮食诱导出胰岛素抵抗，再用小剂量STZ损伤胰

岛，使胰岛素的分泌减少，进而复制出与临床2型糖尿病发病过程相似的动物模型。

但有关高脂、高糖饲料的配方及饲喂时间尚无统一的标准，为此，本研究参考国内外文献报道的方法并通过调整高脂、高糖配方和延长饲喂时间复制2型糖尿病大鼠模型［4~8］。

本实验中，饲喂高脂、高糖饲料12周时大鼠体重显著高于正常对照组，且血清胰岛素水平显著升高，但血糖与正常组相比无差异。

也就是说，高脂、高糖饮食12周诱导出了高胰岛素血症和胰岛素抵抗。

高脂、高糖饮食诱发胰岛素抵抗的机制可能是由于血清甘油三酯

（TG）和游离脂肪酸（FFA）水平增高，FFA通过糖脂肪酸循环、胰岛素信号转导等多个不同途径抑制糖储存，降低胰岛素敏感性，而

导致胰岛素抵抗的发生［9］。

大鼠出现胰岛素抵抗后，再通过注射小剂量STZ（30mg/kg体重）损伤胰腺功能，导致胰腺代偿性分泌胰岛素的功能障碍，最后诱发高血糖。

注射STZ后大鼠胰岛素水平与同期高脂高糖组相比显著降低，与正常对照组相比差异无统计学意义，说明STZ引起胰岛部分破坏，减少了胰岛素的代偿性分泌。

整个实验过程中，成模组大鼠血糖持续在高水平，血清甘油三酯和胆固醇代谢水平亦在不断升高，表明本实验的造模方法稳定且与临床2型糖尿病的慢性发病过程相似。

糖尿病肾病是糖尿病常见的微血管并发症，主要表现为肾脏肥大，持续性蛋白尿和进行性肾功能衰竭等［10］。

本实验高脂高糖组大鼠各项肾脏指标与正常组相比差异均无显著，糖尿病成模8周时即出现肾脏指数、24h尿蛋白量和血肌酐显著升高，且随病程进展持续增加，说明肾脏出现肥大且其滤过功能受损。

形态学观察发现糖尿病

大鼠肾小球体积增大，肾小管管腔扩张，上皮细胞脱落，间质可见炎细胞浸润，说明DM大鼠发生了糖尿病肾病。

因此，本实验动物模型可以作为糖尿病肾病模型进行研究。

SnoN蛋白是TGF-傑/Smads信号通路中重要的核转录抑制因子［11,12］。

本课题组以往的研究显示，该信号通路在单纯STZ注

射复制的1型糖尿病模型肾脏病变的发生、发展中起重要的作用，且SnoN蛋白的表达变化与糖尿病肾病的发生、发展密切相关［3］。

本研究结果显示，单纯的高脂高糖组肾组织中SnoN蛋白的表达与正常组相比差异无显著性。

在高脂高糖饮食基础上注射STZ复制成2型糖

尿病时，随病程进展SnoN蛋白持续减少，成模16周时减少为正常组的64.20%。

本课题组在对1型糖尿病的研究发现，糖尿病8周时SnoN蛋白已减少为正常组的42%，这可能与2型糖尿病病变发展缓慢有关。

而有关SnoN蛋白在2型糖尿病发生、发展中变化的意义及其与其它信号分子的相互作用关系，有待进一步研究。

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