糖尿病大鼠肾脏病变及其SnoN蛋白表达的变化Word文档下载推荐.docx

1、光镜检查肾组织形态学改变。结果：DM组大鼠出现高血糖、 高血脂、肾功能和肾组织形态学改变；HG组血清胰岛素水平、甘油 三酯和总胆固醇明显升高，血糖与 NC组相比差异无统计学意义；Western印迹检测发现DM8组肾组织中SnoN蛋白的表达明显低于 NC组，且随病程进展逐渐减少，至DM16时减至NC组的64.20%。 结论：成功复制了 2型糖尿病动物模型；SnoN蛋白的表达变化可 能参与了 2型糖尿病肾脏病变的发生、发展过程。【关键词】 糖尿病，非胰岛素依赖型； 糖尿病肾病； 大鼠，Sprague-Dawley ； 转录共抑制因子SnoNAbstract Objective: To establ

2、ish type 2 diabetic rat model and observe its renal lesions and SnoN protein expression. Methods: Sprague-Dawley rats were divided into no rmal con trol, high-fat and high-sucrose groups. High-fat and high-sucrose groups were the n divided into high-fat and high-sucrose controls and diabetes mellitu

3、s groups after taking high-fat and high-sucrose diet for 12 weeks. The diabetic rats were injected with low dose of streptozotocin （30 mg/kg） and were killed at the 20th, 24th, and 28th weeks respectively. The SnoN proteins in renal cortex were detected with Western blotting. Blood glucose, serum in

4、sulin concen trati on, trigly-ceride, total cholesterol, serum creati nine and 24 h urine protein were exam ined with biochemistry methods. The renal morphology on HE stained sections was checked with light microscope. Results: Diabetic rats showed hyperglycaemia, hyperlipemia, kidney morphological

5、lesion and renal function cha nges. High-sucrose con trol group showed hyperi nsuli nemia and hyperlipemia, but the blood glucose was no rmal. Wester n blott ing results showed that the expression of SnoN in diabetic renal tissues significantly decreased （P0.01）. Conclusions: Rat models of type 2 di

6、abetes mellitus have bee n established successfully which can be used as a diabetic n ephropathy model. The cha nge of SnoN protein expression may play a role in the mechanisms of type 2 diabetic n ephropathy.Key words diabetes mellitus , non-insulin-dependent; diabetic nephrosis ; rats,Sprague-Dawl

7、ey ; transcription co-repressor SnoN 糖尿病是严重威胁人类健康的以高血糖为特征的代谢性疾病， 其中2型糖尿病（T2DM）的发生在国外占整个糖尿病比例的 85%95%，国 内报道则在90%以上1。但目前国内糖尿病的研究多采用大剂量链 脲佐菌素（streptozoticin,STZ ）诱导的1型糖尿病模型，国外对 2 型糖尿病的研究亦大多采用价格昂贵的自发性动物模型， 并且其特点是遗传因素在发病过程中占主导地位，与临床上的发病特征不完全吻 合。而对于膳食加小剂量 STZ注射诱导的与临床发病过程相近的 2型糖尿病模型的复制方法，目前尚无统一的标准2。引起糖尿病患者

8、 死亡的主要原因是其血管并发症，而糖尿病肾病即是其常见的微血管 并发症之一。以往的研究发现核转录共抑制因子 SnoN蛋白的表达变化与STZ诱导的糖尿病大鼠肾病的发生、发展过程密切相关3。2007 年8月2008年8月采用高脂、高糖饮食加小剂量 STZ腹腔注射的方法，通过调整饮食结构和饲喂时间探讨 2型糖尿病模型的复制，并 对其发病过程中肾脏病变及 SnoN蛋白的表达变化进行观察。1材料和方法1.1材料1.1.1动物和试剂 Sprague-Dawley （SD）大鼠30只，雄性，体 重（200 20）g,由贵阳医学院实验动物中心提供。 STZ购于美国Sigma公司；SnoN抗体购于美国Santa

9、 Cruz公司；B-actin单克隆 抗体及DAB显色剂和辣根过氧化物酶标记的二抗购于武汉 Boster公司；Western 印迹用 PVDF膜，3 mm Whatman 滤纸购于美国 milli-pore公司；胆固醇购于北京双旋微生物培养基制品厂；胰岛素 测定试剂盒购自天津九鼎生物医学工程有限公司； TG和TC测定试剂盒购自四川迈克有限公司；考马斯亮蓝测定试剂盒购于南京建成生 物工程研究所。1.1.2主要器材 日本京都血糖仪；高速低温离心机（美国Beckman 公司）；核酸蛋白分析仪（美国 Amersham公司）；电泳系统及电转 移装置（美国Amersham公司）；凝胶成像系统（美国 Bio

10、-RAD公 司）。1.2方法1.2.1动物分组将SD大鼠随机分成正常对照组（NC , n=6）、高脂 高糖组（HG, n=24 ）。高脂高糖组喂养12周后又随机分为高脂高糖 对照组（HC, n=6 ）、糖尿病组（DM , n=18 ）。成模大鼠随机分别于 糖尿病 8 周（DM8 , n=6 ）、12 周（DM12 , n=6）和 16 周（DM16 , n=6）处死。NC组以常规饲料喂养，各组大鼠均自由饮水。1.2.2饮食诱导胰岛素水平升高 大鼠适应性饲养1周后，HG组以 高脂、高糖饲料喂养，饲料组成如下：67%常规饲料、20%蔗糖、10% 猪油、2%胆固醇、1%蛋黄。喂养12周时，称体重，测

11、空腹血糖， 尾动脉取血测血清胰岛素水平。123小剂量STZ注射诱导糖尿病 高脂、高糖饮食12周后,DM组 大鼠按30 mg/kg剂量腹腔注射STZ （以pH4.5、0.01 mol/L无菌枸 橼酸缓冲液配成1%浓度）。72 h后测空腹血糖，血糖值13.8 mmol/L 者作为2型糖尿病大鼠，18只大鼠全部建模成功。1.2.4动物标本的采集 分别于试验的第20周、24周和28周时处 死DM8、DM12和DM16各组大鼠，于28周时一并处死NC和HC 组大鼠。处死前代谢笼留24 h尿液，称体重，股动脉取血；开腹取 肾脏，称肾重，一侧肾脏固定于 4%多聚甲醛，另一肾脏于-80 C保 存供Wester

12、n印迹检测。1.2.5生化检测氧化酶（GOD-PAP ）法测血清葡萄糖；放免法测 血清胰岛素水平；考马斯亮蓝法测尿蛋白浓度，尿蛋白浓度与 24 h尿量的乘积为24 h尿蛋白量；血甘油三酯和胆固醇测定均按试剂说 明书操作。1.2.6肾组织形态学观察 多聚甲醛固定的肾脏组织行石蜡切片，经 HE染色后光镜观察肾组织形态学改变。1.2.7 Western印迹检测 取-80 C保存的各组大鼠肾皮质，每组100 mg，分别加入组织蛋白提取液后匀浆、离心、取上清，考马斯 亮蓝法测定各组蛋白质浓度，每个样品上样 150，按所测得浓度计算各样品所需体积，加入2倍上样缓冲液煮沸10 min。经12%的SDS-PA

13、GE凝胶电泳分离，再转移至 PVDF膜上，脱脂奶粉室温封闭1 h，加入SnoN或B-actin 抗，工作浓度均为1 100 , 4 C孵育 过夜。复温45 min，TBST洗膜后，加入相应的辣根过氧化物酶标记 的二抗（浓度均为1 5 000 ）室温孵育2 h，加DAB显色液显色。凝 胶成像系统进行图像分析，用 Quantity one软件分析蛋白条带，测 定各条带的面积和灰度值，二者乘积为积分灰度值，以 SnoN与B-actin的积分灰度值比值为SnoN蛋白相对值，取3次重复测定值之 均数。1.2.8数据分析 所有数据以xs表示，采用SPSS11.5软件处理， 两组间比较采用t检验,多组间比较

14、采用单因素方差分析。2结果2.1高脂、高糖饮食对各组大鼠体重、血糖及血清胰岛素的影响高脂、高糖饮食12周时，与NC组相比，HG组大鼠体重及血清 胰岛素水平显著增加（P0.01）;空腹血糖与NC组相比差异无显著性（P0.05 ），见表1。表1饮食对各组大鼠体重、血糖及胰岛素的影响（1）与正常对照组相比，P0.012.2小剂量STZ注射后对各组大鼠血糖、血清胰岛素、血清甘油三 酯及胆固醇的影响注射STZ后& 12及16周，DM各组空腹血糖均明显高于未注射 的28周的NC组和HC组，差异有显著性（P0.01 ）;血清胰岛素较 注射STZ前明显下降且显著低于 HC组（P0.01），但与NC组相比差 异

15、无显著性。DM组各组血清甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）均 显著高于NC组（P0.01），且随病程进展而升高，至 DM12和DM16 时显著高于HC组（P0.01）。见表2。2.3血肌酐、24 h尿蛋白及肾脏指数大鼠在注射STZ后8周，血肌酐（Scr）、24 h尿蛋白（24 h urine protein,24UP ）及肾脏指数（kidney index,KI ）均显著高于 NC 组和HC组（P0.01），且随病程进展逐渐升高。HC组与NC组相比 血肌酐、24 h尿蛋白及肾脏指数差异均无显著性，见表 3。2.4肾组织形态学变化HE染色下见正常组肾小球形态完整、轮廓清晰；肾小管未见异常。 DM

16、16组肾小球体积增大和表2不同时点糖尿病组的血糖、胰岛素、 甘油三脂及胆固醇表3各组大鼠血肌酐、24 h尿蛋白及肾脏指数的 变化系膜基质增生；肾小管管腔扩张，上皮细胞脱落，部分肾小管基 底膜不完整，间质可见炎细胞浸润。见图 1。2.5 Western免疫印迹结果NC组和HC组大鼠SnoN表达较多，SnoN与p-actin的积分灰度 值之比分别为0.81 ）.06和0.94 0.16，两组间差异无统计学意义。 DM8组为0.63 0.05，与NC组相比显著减少，随着DM的进展SnoN 的表达逐渐减弱，至 DM16组时减少为正常组的 64.20% （0.52 0.11 ）。见图 2。3讨论2型糖尿

17、病是由于胰岛素抵抗和胰岛素分泌障碍两方面缺陷引起的。其中胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要始发因素，贯穿于2型糖尿 病的发生、发展整个过程。胰岛素抵抗发生后，只要胰腺能维持足够的胰岛素分泌量来克服胰岛素抵抗，那么糖耐量将保持正常或只有轻 微受损。而一旦B细胞功能开始下降，糖耐量将迅速降低，并发展成 糖尿病。目前，国内外2型糖尿病模型的复制多数即根据此原理， 先通过高脂、高糖饮食诱导出胰岛素抵抗，再用小剂量 STZ损伤胰岛，使胰岛素的分泌减少，进而复制出与临床2型糖尿病发病过程相 似的动物模型。但有关高脂、高糖饲料的配方及饲喂时间尚无统一的 标准，为此，本研究参考国内外文献报道的方法并通过调整高脂、高

18、 糖配方和延长饲喂时间复制2型糖尿病大鼠模型48。本实验中，饲喂高脂、高糖饲料12周时大鼠体重显著高于正常对 照组，且血清胰岛素水平显著升高，但血糖与正常组相比无差异。也 就是说，高脂、高糖饮食12周诱导出了高胰岛素血症和胰岛素抵抗。 高脂、高糖饮食诱发胰岛素抵抗的机制可能是由于血清甘油三酯（TG）和游离脂肪酸（FFA）水平增高，FFA通过糖脂肪酸循环、 胰岛素信号转导等多个不同途径抑制糖储存， 降低胰岛素敏感性，而导致胰岛素抵抗的发生9。大鼠出现胰岛素抵抗后，再通过注射小剂 量STZ（30 mg/kg体重）损伤胰腺功能，导致胰腺代偿性分泌胰岛素 的功能障碍，最后诱发高血糖。注射 STZ后大鼠

19、胰岛素水平与同期 高脂高糖组相比显著降低，与正常对照组相比差异无统计学意义， 说 明STZ引起胰岛部分破坏，减少了胰岛素的代偿性分泌。整个实验 过程中，成模组大鼠血糖持续在高水平，血清甘油三酯和胆固醇代谢 水平亦在不断升高，表明本实验的造模方法稳定且与临床 2型糖尿病 的慢性发病过程相似。糖尿病肾病是糖尿病常见的微血管并发症，主要表现为肾脏肥 大，持续性蛋白尿和进行性肾功能衰竭等10。本实验高脂高糖组大 鼠各项肾脏指标与正常组相比差异均无显著， 糖尿病成模8周时即出 现肾脏指数、24 h尿蛋白量和血肌酐显著升高，且随病程进展持续 增加，说明肾脏出现肥大且其滤过功能受损。 形态学观察发现糖尿病大

20、鼠肾小球体积增大，肾小管管腔扩张，上皮细胞脱落，间质可见炎 细胞浸润，说明DM大鼠发生了糖尿病肾病。因此，本实验动物模型 可以作为糖尿病肾病模型进行研究。SnoN蛋白是TGF- 傑/Smads信号通路中重要的核转录抑制 因子11,12。本课题组以往的研究显示，该信号通路在单纯 STZ注射复制的1型糖尿病模型肾脏病变的发生、发展中起重要的作用，且 SnoN蛋白的表达变化与糖尿病肾病的发生、发展密切相关 3。本研 究结果显示，单纯的高脂高糖组肾组织中SnoN蛋白的表达与正常组 相比差异无显著性。在高脂高糖饮食基础上注射 STZ复制成2型糖尿病时，随病程进展SnoN蛋白持续减少，成模16周时减少为正

21、常 组的64.20%。本课题组在对1型糖尿病的研究发现，糖尿病 8周时 SnoN蛋白已减少为正常组的42%，这可能与2型糖尿病病变发展缓 慢有关。而有关SnoN蛋白在2型糖尿病发生、发展中变化的意义及 其与其它信号分子的相互作用关系，有待进一步研究。【参考文献】1高苹,贾汝汉.2型糖尿病肾病大鼠模型的建立 J.中国中西医结合肾病杂志,2007（6） : 316-319.2余臣祖，张朝宁,刘国安实验性2型糖尿病动物模型研究进展 J.医学综述,2006（1） : 41-42.3刘瑞霞，郭兵，崔龙，等.SnoN蛋白在糖尿病大鼠肾组织中的表 达及其意义J.中国病理生理杂志，2008（6）:1188-1

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