原位杂交组织化学Word格式文档下载.docx

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①对DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交，需进行灭活RNA酶处理水（包括用0.5‰的二乙基焦碳酸盐（diethylpyrocarbonate,DEPC）配制有关试剂和160-180℃烘烤实验用器皿等）；

当使用双链CDNA探针和/或待测靶序列是DNA时，需进行变性处理使DNA解链；

②杂交温度应低于杂交体的解链温度（Tm）25℃左右；

③对照实验:

原位杂交远较免疫组化染色复杂，影响因素颇多，故对照实验是必不可少的，有组织对照，探针对照，杂交反应体系对照和检测系统的对照等，可根据具体情况选用。

（三）荧光原位杂交

可以用直接法或间接法进行荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）,前者是以荧光素直接标记已知DNA探针，后者是以非荧光标记物标记已知DNA探针，再桥连一个荧光标记的抗体。

FISH检测的靶序列也是DNA,即是一种DNA-DNA杂交。

FISH的探针有不同的类型，如重复序列探针，位点特异性探针和全染色体探针等，目前已有大量商品化的荧光标记探针，使FISH技术得到越来越多的应用。

（四）原位杂交技术的应用

原位杂交可应用于:

①细胞特异性mRNA转录的定位，可用于基因图谱，基因表达（图17-5）和基因组进化的研究；

②感染组织中病毒DNA/RNA的检测和定位，如EB病毒mRNA、人类乳头状瘤病毒和巨细胞病毒DNA的检测；

癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的检测；

④基因在染色体上的定位；

检测染色体的变化,如染色体数量异常和染色体易位等；

⑥分裂间期细胞遗传学的研究，如遗传病的产前诊断和某些遗传病基因携带者的确定，某些肿瘤的诊断和生物学剂量测定等。

原位杂交和免疫组化染色技术相比较，IHC使用的是抗体，其检测对象是抗原，机制是抗原-抗体的特异性结合，是蛋白质表达水平的检测；

FISH使用的是探针，遵循碱基互补配对的原则与待检靶序列结合，是DNA或mRNA水平的检测。

二者均有较高的敏感性和特异性,但FISH更容易受到外界因素的影响。

一般原位杂交操作规程

（一）

[仪器设备]

医用微波炉；

水浴锅。

[试剂]

1.2mol/LHCl：

HCl8.2ml，H20定容0.5L。

0.1mol/L三乙醇胺（pH8.0）:

三乙醇胺5.33ml，H20定容0.4L。

.5ml/L醋酸-2.5ml/L醋酸酐:

三乙醇胺13.2ml，NaCl5g，浓HCl4ml，H20定容0.98L，醋酸酐（用前加）2.5ml。

20×

SSC（pH7.0）：

NaCl175.3g，枸橼酸钠88.2g，H20定容1L。

100×

Denhardt'

s：

Ficoll1g，PVP1g，BSA1g，H20定容50ml。

杂交液：

Formamide5ml，20×

SSC2.5ml，Dextransulfate1g，100×

s0.5ml，10%SDS0.5ml，10g/LspermDNA0.1ml，H201.4L。

BufferⅠ（pH7.5）：

0.1mol/Lris·

Cl，0.15mol/LNaCl。

BufferⅢ（pH9.5）：

0.1mol/LTris·

Cl，0.1mol/LNaCl，0.05mol/LMgCl2。

BufferⅣ（pH8.0）：

10mmol/LTris·

Cl，1mmol/LEDTA。

[操作流程]

1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天

1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；

2）无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；

3）95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；

4）PBS清洗3分钟；

5）2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；

6）PBS清洗10分钟；

7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分钟；

8）PBS清洗2次，每次3分钟；

9）0.2N的HCl孵育30分钟；

10）PBS清洗2次，每次3分钟；

11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；

12）PBS清洗2次，每次5分钟；

13）预杂交缓冲液孵育30分钟；

14）准备核酸探针混合物：

使用预杂交缓冲液稀释探针，85℃加热5分钟，置于冰块中10分钟；

15）杂交；

第二天

16）将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；

17）PBS清洗3分钟；

18）RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分钟；

19）PBS清洗5分钟；

20）室温，2×

SSC清洗10分钟；

21）37℃，1×

22）37℃，0.5×

23）缓冲液A孵育10分钟；

24）缓冲液A（1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100）孵育30分钟；

25）加入抗地高辛抗体（1/200的上述缓冲液，来自BoehringerMannheim），37℃孵育3小时；

26）缓冲液A清洗2次，每次10分钟；

27）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；

28）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时；

29）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；

30）固红，脱水以及封片进行核的复染。

第一节　原位杂交组织化学概述

　　一、核酸分子杂交技术

　　1961年Hall开拓了液相核酸杂交技术的研究，其基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链。

自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是70年代末到80年代初，分子克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，核酸自动合成仪的诞生，大大丰富了核酸探针的来源，新的核酸分子杂交类型和方法不断涌现。

按其作用方式可大致分为固相杂交和液相杂交两种：

液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，而固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上（常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。

固相杂交有菌落原位杂交（colonyinsituhybridization）、斑点杂交法（Dotblot）、Southern印迹杂交（Southernblot）、Northern印迹杂交（Northernblot）和组织原位杂交（Tissueinsituhybridization），即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。

液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等（详见第十八章　）。

　　二、原位杂交组织化学技术的由来及发展

　　原位杂交组织（或细胞）化学技术简称原位杂交（Insituhybridization），如上所述，属于固相核酸分子杂交的范畴。

但它区别于固相核酸分子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术。

菌落杂交系细菌裂解释放出DNA，然后进行杂交。

Southern印迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定的基因片段，而Norhtern印迹杂交法是用以检测某一特定的RNA片段的。

它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。

1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。

与此同时，Buongiorno–Nardelli和Amaldi,John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交细胞或组织化学技术。

Orth（1970）应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位，但当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探针均采用同位素标记。

　　由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，科学工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交。

Bauman（1981）等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。

Shroyer（1982）报道用2，4二硝基苯甲醛（DNP）标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。

这两种方法至今仍有采用，但因敏感度不够高，应用不够普遍。

　　Pezzella（1987）创建了用磺基化DNA探针来做细胞或组织原位杂交的方法，其基本原理是使DNA探针的胞嘧啶碱基磺基化，利用单克隆抗体识别磺基化探针，再通过免疫组化方法显示结合的单克隆抗体，从而对杂交结合的探针进行定位。

本法的优点是磺基化DAN探针标记简便，不需作缺口平移标记，敏感度也较高。

但自生物素和高辛标记探针技术建立后，已有取而代之的趋势。

生物素标记探针技术是Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素标记的探针在组织切片上检测了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶-抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位。

生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。

这种生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。

另一种叫光促生物素标记核酸技术，该技术是用光敏生物素（Photobiotin）标记核酸。

目前应用的光敏生物素有乙酸盐和补骨脂素生物素，它们都是由三个部分组成：

光敏基团、连结臂和生物素（图20-1）。

在强光下，不需酶反应，光敏生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。

光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也不低，但标记效率不高，每100～150个碱基才能标记一个生物素，对于短的基因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用，以免因标记数过少而影响灵敏度（Forsteretal1985）。

图20-1　光敏生物素结构图

　　近年来，地高辛（Digoxigonin）标记技术引起科技工作者的极大兴趣。

BoeringerMannhemBio－chemisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场。

和其它非放射性标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。

同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，可以检测出人基因组DNA中的单拷贝基因。

地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色（标记碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色系统），有较好的反差背景。

　　核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。

根据探针的核酸性质不同可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核苷酸探针等。

DNA探针还有单链DNA（Singlestranded,ssDNA）和双链DNA（Doublestranded,dsDNA）之分（详见十九章　）。

早期应用的主要是DNA探针，继之Temin在70年代研究致癌RNA病毒时制备了cDNA探针（complementaryDNA），其基本原理是以RNA为模板，经逆转录酶（reversetranscriptase）又称为RNA指导的DNA聚合酶催化产生的。

该酶以RNA为模板，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA，这一途径与一般遗传信息流的方向相反，故称逆转录。

CDNA是指互补于mRNA的DNA分子。

RNA探针是将特异性的cDNA片段插入含有相当的RNA聚合酶启动子的转录性载体。

这类载体包括pSP64和pSP65，它们具有不同的启动子在多克隆位点的各侧。

Psp64和pSP65在sP6启动子的多克隆位点的方向是不同的。

通过改变外源基因的插入方向或选用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的转录方向，即以哪条DNA链为模反转录RNA。

从而可以得到与mRNA同序列的同义RNA探针（Senseprobe）和与mRNA互补的反义RNA探针（antisenseprobe），又称互补RNA探针（complementaryRNAprobe,cRNA）。

通常用同义RNA探针做为反义RNA探针的阴性对照。

由于RNA探针是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应极高。

有报告认为其杂交率高于DNA探针的8倍。

　　DNA合成仪的诞生使制造寡核苷酸探针成为可能，与上述探针不同的是寡核苷酸探针不是克隆性DNA探针，它是由DNA合成仪依照所需杂交的靶核苷酸序列合成的。

具有制造方便，价格低廉的优点，也可进行放射性与非放射性标记，但其特异性不如克隆性探针强，亦不如其杂交信号高。

　　原位杂交组织化学技术在近20年的发展可以说是飞跃的，其突出的特点是由分子遗传学研究提供的探针大量增加，探针生产的可靠性和速率大大发展了，更重要的是非放射性标记物的发展使原位杂交组织化学技术在不久的将来将和现今的免疫细胞化学技术一样成为实验室的常规技术和临床日常应用的诊断技术。

新的非放射性标记技术正在继续不断涌现。

Coulton（1991）建议将非放射性标记技术更名为亲合复合物标记技术（Affinity–ComplexLabelledProbes,ACLP）。

因为“非（non）“在英文里是一个否定的名词，而且根据非放射性标记技术的原理是将一个标记物利用其亲合性，应用直接或间接的方法结合在核苷酸分子上。

　　原位杂交组织化学技术在生命科学的研究中可视为一项革命性的技术。

它使它们的研究从器官、组织和细胞水平走向分子水平。

为各个学科的研究带来突破性的进展。

其中特别突出的是细胞或组织的基因表达、染色体分析、病毒诊断和发育生物学。

我们在下节　将详加叙述。

　　三、原位杂交组织化学技术的基本方法

　　如前所述，由于核酸探针的种类和标记物的不同，在具体应用的技术方法上也各有差异，但其基本方法和应用原则大致相同。

大致可分为：

①杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；

②杂交；

③杂交后处理；

④显示（visual－ization）：

包括放射性自显影和非放射性标记的显色。

（一）固定

　　原位杂交组织化学技术（InSituHybridizationHistochemistry,ISHH）在固定剂的应用和选择上应兼顾到三个方面：

保持细胞结构，最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；

使探针易于进入细胞或组织。

DNA是比较稳定的，mRNA是相对稳定的但易为酶合成和降解。

RNA却绝然不同，非常容易被降解。

因此，对于DNA的定位来说，固定剂的种类和浓度并不十分重要。

相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解减少到最低限度，那么，不仅固定剂的种类浓度和固定的时间十分重要，而且取材后应尽快予以冷冻或固定。

在解释ISHH的结果时应考虑到取材至进入固定剂或冰冻这段时间对RNA保存所带来的影响，因组织中mRNA的降解是很快的。

在固定剂中，最常用的是多聚甲醛。

和其它的固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。

其它如醋酸-酒精的混合液和Bouin’s固定剂也能获得较满意的效果。

对于mRNA的定位，我们常采用的方法是将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中1～2h，在冷冻前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。

组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入4%多聚甲醛约10min，空气干燥后保存在-70℃。

如冰箱温度恒定，在-70℃可保存数月之久不会影响杂交结果。

在病理学活检取材多用福尔马林固定和石蜡包埋，这种标本对检测DNA和mRNA有时也可获得杂交信号，但石蜡包埋切片由于与蛋白质交叉连接的增加，影响核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片。

同时，在包埋的过程中可减低mRNA的含量。

其它固定剂如应用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷冻切片也可获得满意效果。

各种固定剂均有各自优缺点，如沉淀性（Precipitating）固定剂：

酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、Carnoy’s液等能为增加核酸探针的穿透性提供最佳条件，但它们不能最大限度地保存RNA，而且对组织结构有损伤。

戊二醛能较好地保存RNA和组织形态结构，但由于和蛋白质产生广泛的交叉连接，从而大大地影响了核酸探针的穿透性。

至今，多聚甲醛仍被公认为ISHH较为理想的固定剂。

（二）玻片和组织切片的处理

　　1．玻片的处理玻片包括盖片和载片应用热肥皂刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡24h，清水洗净烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸馏水冲洗、烘干，烘箱温度最好在150℃或以上过夜以去除任何RNA酶。

盖玻片在有条件时最好用硅化处理，锡箔纸包裹无尘存放（硅化方法见附录）。

　　由于ISHH的实验周期长，实验程序繁杂，因此，要应用粘附剂预先涂抹在玻片上，干燥后待切片时应用，以保证在整个实验过程中切片不致脱落。

常用的粘附剂有铬矾-明胶液，其优点是价廉易得，但在长周期实验过程中，粘附效果不够理想。

多聚赖氨酸液具有较好的粘附效果，但价格昂贵，需进口。

近年VectorLab（U.S.A.）推出一种新的粘附剂叫VectorbandReagent,每一单位包装可制备500～700张载玻片，粘附效果极佳，价格较多聚赖氨酸便宜，制片后可长期保存应用。

目前国内尚无生产，需国外进口（配方见附录2）。

　　2．增强组织的通透性和核酸探针的穿透性此步骤根据应用固定剂的种类、组织的种类、切片的厚度和核酸探针的长度而定。

比如用戊二醛固定的组织由于其与蛋白质产生广泛的交叉连接就需要应用较强的增强组织通透性的试剂。

增强组织通透性常用的方法如应用稀释的酸洗涤、去垢剂（detergent）或称清洗剂TritonX-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等。

这种广泛的去蛋白作用无疑可增强组织的通透性和核酸探针的穿透性，提高杂交信号，但同时也会减低RNA的保存最和影响组织结构的形态，因此，在用量及孵育时间上应慎为掌握。

　　蛋白酶K（ProteinaseK）的消化作用在ISHH中是应用于蛋白消化的关键步骤，其浓度及孵育时间视组织种类、应用固定剂种类、切片的厚薄而定。

一般应用酶k1μg/ml（于0.1mol/lTris/50mmol/LEDTA,pH8.0缓冲液中）,37℃孵育15～20min，以达到充分的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为目的。

蛋白酶K还具有消化包围着靶DNA的蛋白质的作用，从而提高杂交信号。

在蛋白酶K消化后，应用0.1mol/L的甘氨酸溶液（在PBS中）清洗以终止蛋白酶K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶K的抑制剂。

为保持组织结构，通常用4%多聚甲醛再固定。

Burns等（1987）报告应用胃蛋白酶（Pepsin）20～100μg/ml（用0.1nHCl配）37℃、30min进行消化，所获实验结果优于蛋白酶K。

　　不少实验工作者在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐（aceticanhydride）和三乙醇胺（tri－ethanolamine）中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色。

有的作者除在室温下浸于上述溶液10min外，还在预热37℃的50%甲酰胺/2×

SSC液中预杂交15min，然后用2×

SSC，0.30mol/lNaAc/0.030mol/L枸橼酸钠液中浸15min。

但Heinz、Hofer等一些著名学者却对此持有异议，根据他们的实验和经验证明，乙酸酐和三乙醇胺液的处理并不能起到减低背景的目的，不能改善ISHH的信/噪比例。

　　3．减低背景染色和免疫细胞化学染色一样ISHH实验程序中，如何减低背景染色是一个重要的问题。

ISHH中背景染色的形成是诸多因素构成的。

杂交后（Posthybridization）的酶处理和杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。

　　预杂交（Prehybridization）是减低背景染色的一种有效手段。

预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖（Dextransulphate）。

将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。

　　有的实验室在杂交后洗涤中采用低浓度的RNA酶溶液（20μg/ml）洗涤一次，以减低残留的和内源性的RNA酶，减低背景染色。

　　4．防止RNA酶的污染由于在手指皮肤及实验用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。

所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温（240℃）烘烤以达到消除RNA酶的目的。

要破坏RNA酶，其最低温度必须在150℃左右。

有条件的国外实验室在消毒的玻璃器皿外包以锡箔纸以利于标记和防止取出时空气污染。

在无高温消毒的烤箱时，亦可用国内出产的卫生蒸汽消毒锅（山东新华医疗器材厂生产）。

杂交前及杂交时所应用的溶液均需经高压消毒处理。

　　（三）杂交