四川农业大学研究生高级生物化学实验报告Word下载.docx
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VeⅢ=V0+Vi
图1凝胶层析柱洗脱的三部分示意图
Vo表示外体积；
Vi内体积；
VeII、VeIII分别代表组分II和III的洗脱体积。
Kd可以有下列几种情况：
1、当Kd=0时，则Ve=Vo。
即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质（全排阻），洗脱体积等于空隙体积（图1组分Ⅰ）。
2、当Kd=1时，Ve=Vo+Vi。
即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内体积之和（图1组分Ⅲ）。
可以看出，对某一凝胶介质，两种全排出的分子即Kd都等于零，虽然分子大小有差别，但不能有分离效果。
同样两种分子如都能进入内部空隙，即Kd都等于1，它们即使分子大小有不同，也没有分离效果。
因此不同型号的凝胶介质，有它一定的使用范围。
3、当0<
Kd<
1时，Ve=Vo+KdVi。
表示内体积只有一部分可被组分利用，扩散渗入，Vo即在Vo与Vo+Vi之间变化（图1组分Ⅱ）。
4、有时Kd>
1时，表示凝胶对组分有吸附作用，此时Ve>
Vo+Vi。
例如一些芳香化合物的洗脱体积远超出理论计算的最大值，这些化合物的Kd>
1。
在实际工作中，对小分子物质也得不到Kd=1的数值，特别是交联度大的凝胶差别更大，这是由于一部分水相与凝胶结合较牢固，成为凝胶本身的一部分，因而不起作用，小分子不能扩散人内所致。
此时Vi不能由g·
WR计算，为此也常有直接用小分子物质D2O，NaCl等通过凝胶柱而由实验计算出Vi值的。
另一个解决的办法是不使用Vi与Kd．而用Kav（有效分配系数）代替Kd，其定义如下：
已知
Kd=（Ve-Vo）/Vi
Vt-Vo代替Vi，则：
Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）
即
Ve＝Vo+Kav（Vt-Vo）
这在实际上将原来以水作为固定相（Vi）改为水与凝胶颗粒Vt-Vo作为固定相．而洗脱剂（Ve-Vo）作为流动相。
Kav与Kd对交联度小的凝胶差别较小，而对交联度大的凝胶差别大。
Ve与相对分子质量的关系：
对同一类型的化台物，洗脱特性与组分的相对分子质量有关，流过凝胶柱时，按从大小顺序流出，分子量大的走在前面。
Ve与分子量的关系可用下式表示：
Ve=K1-K2logM
K1与K2为常数．M为相对分子质量。
凝胶层析技术操作方便，设备简单，重复性好，而且条件温和，一般不引起生物活性物质的变化，目前已得到相当广泛的应用，例如可用于脱盐，浓缩高分子物质的溶液，生化物质的分离提纯，去除热原物质以及用于测定高分子物质的分子量。
二、试剂和器材
【试剂】
1、标准蛋白质：
蓝色葡聚糖-2000（200KD），牛血清血蛋白（67KD），胃蛋白酶（36KD），CytC（13.7KD）等，均为分析纯。
2、洗脱液：
0.2mol/LTris-HCl-KCl，pH7.5
取0.5MKCl20ml，0.2MTris25ml，0.1MHCl40.3ml，再加H2O定容至100ml
3、SephadexG-75（或G-100）。
【器材】层析柱：
柱管1*40cm；
核酸蛋白检测仪（或紫外分光光度计）；
部分收集器刻度试管。
三、操作步骤
（一）凝胶柱的准备
1、凝胶的选择和处理
[1]凝胶的选择：
凝胶的型号很多，型号不同，筛分范围不同。
市售的Sephadex的分离范围，常用高聚糖或球蛋白测定。
SephadexG型一般适用于分离蛋白质，若用于分离核酸，则限于其空间结构和所带基团的影响，选用高于他们分子量范围的型号，或则选用适当型号的生物胶和Sephadex1。
在去除蛋白质溶液中的盐类时，可选用凝胶SephadexG-25。
当溶液通过G-25柱时，蛋白质被排阻在凝胶外面先流出来，而盐类则扩散到凝胶网孔里后流出来，这样就使蛋白质得到纯化。
一般来说，在规定的筛分范围内，混合物之间分子量差别越大，分离效果越好。
[2]凝胶的处理：
葡聚糖凝胶是以干粉保存的，因此使用前必须将干凝胶浸泡于将要用作洗脱剂的相同溶液中，充分溶胀后才能使用。
根据层析柱的体积和所选用的凝胶，膨胀后的床体积，计算所需凝胶于粉的重量，将称好的干粉倾入过量的洗脱液中，一般多为蒸馏水、盐溶液或缓冲液，放置于室温，使之充分吸水溶胀。
注意不要剧烈搅拌，以防颗粒破碎。
浸泡时间根据凝胶交联度不同而异，为了缩短溶胀时间，可在100℃恒温水浴箱中加热溶胀，这样可大大缩短溶胀时间至几小时，而且还可杀死细菌和霉菌，排除凝胶内部包藏着的气泡。
但是，必须避免置于酸或碱溶液中加热。
凝胶颗粒最好大小比较均匀，这样流速稳定，结果较好。
如果颗粒大小不匀，可以在浸泡时用倾泻法将不易沉下的较细的颗粒倾去。
装柱前最好将溶胀好的凝胶置真空干燥器中抽真空，以除尽凝胶中的空气。
2、凝胶柱的制备
[1]柱的选择：
层析柱是所有层析方法的主要组成部分。
因此，对层析柱（包括体积和长度等）选择的合理与否，将直接影响分离效果。
当用同样直径的层析柱分离两种以上的物质时，长层析柱比短的分辨率高；
当用同样长度的层析柱分离两种以上的物质时，层析柱直径大的比小的分辨率高；
当用同样体积的层析柱分离两种以上物质时，仍时层析柱长的比短的分辨率高。
一般理想的层析柱之直径和长度之比是1：
25～100。
层析柱最好有架套，这样温度可以控制，得到的结果可以重复。
[2]装柱：
层析柱必须粗细均匀，柱管大小可根据实际需要选择。
一般柱直径（半径）为1cm，如果样品样比较多，最好用直径2-3cm柱。
但若直径太小时会发生“壁管效应”，即在柱管中心部分组分移动较慢，而在管壁周围移动较快，因而影响分离效果。
一般说来，柱越长，分离效果愈好，但柱过长，实验时间长，而且样品稀释度大，易扩散，分离效果反而不好。
一般来说，用于脱盐时，柱高50cm比较合适；
在进行分级分离时，100cm高就已足够。
装柱方法与一般柱层析法相似，柱管可用一般柱层析管，柱的下端缩口，底部目前常用多孔的聚乙烯片做底板。
底下用棉花或玻璃纤维填弃。
如用烧结玻璃砂板做底，尽管用细孔的（3号），粗孔的则要在其上铺一层滤纸或尼龙滤布。
先加适量溶剂到柱内，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的凝胶搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱内，待其自然沉降至柱高的1/4～1/3时，打开柱下端出口，让溶剂慢慢流入，使柱上端悬浮液面缓慢下降至需要的高度。
要注意颗粒间没有夹杂气泡，最好不用分次填装法或稀的凝胶悬浮液装柱。
凝胶沉集后，将溶剂放出，再通过2-3倍柱床体积的溶剂使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防在加样时凝胶被冲起来。
[3]凝胶柱的鉴定：
红色葡聚糖或细胞色素C等配成2毫克/毫升的溶液过柱，观察色带是否均匀下降。
如果凝胶是均匀的，没有“纹路”、裂缝或气泡，才可以使用，否则就必须重新装柱。
要注意在任何时候不要使液面低于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干，分离效果变坏，并有可能混有气泡，影响液体在柱内的流动。
3、加样
加样量与测定方法和层析柱大小有关。
测定样品含量的方法灵敏或床柱体积小时，加样量可少。
否则反之。
例如，一般测定蛋白质的含量多用紫外分光光度法。
当采用280nm观察消光读数时，加样量需5mg左右（柱体积2*60cm）；
当采用220nm观察消光读数时，加样量只需要1.2mg左右。
加样量掌握得当，可提高分离效果。
一般来说，加样量越少，或加样体积越小（样品浓度高），分辨率越高。
但用于样品的制备和脱盐时，加样量应在不影响分辨率的前提下增大。
此外，样品的粘度也影响层析的分辨率，样品的粘度大比小分辨率低。
因此，一般使用的样品粘度应小于2，或者与洗脱液的粘度相当为宜。
加样的方法与一般柱层析法相同，将柱中多余的液体放出后，将样品溶液小心加到凝胶柱上，打开管夹，使样品溶液流入柱内。
然后加入溶剂或盐溶液洗脱。
4、洗脱
所有洗脱液均以能溶解洗脱物质和不使其变性或失活为原则。
洗脱用的液体应与浸泡膨胀凝胶所用的液体相同，否则由于更换溶剂，凝胶体积发生变化而影响分离效果。
洗脱所用的液体有水（多用于分离不带电荷的中性物质）及电解质溶液（用于分离带电基团的样品），如酸、碱、盐的溶液及缓冲液等。
对于吸附较强的组分，也有使用水与有机溶剂的混合液，中水-甲醇，水-乙醇，水-丙酮等，如以此作为洗脱剂，可以减低吸附，将组分洗下。
洗脱时的流速要严格控制。
否则收集的每一部分洗脱体积就不会恒定，理想的分配系数就难以测出。
控制流速的最好装置是恒流泵，它不仅可以使流速恒定，而且还可以使其在较大范围内选择。
若无此装置，可用控制操作压的办法进行。
事实上，大多数实验室是采用后一种方法进行控制流速的。
流速在洗脱液加在柱上的压力（因液面差造成）有关。
凝胶层析与一般离子交换树脂不同，加压超过一个极限值，不仅不能增加速度，反而使流速急剧下降。
流速对交联度不同的凝胶是不同的。
对交联度大的凝胶（G-10至G-50型），流速与柱的压力差成正比，与柱长成反比，与柱的直径无关。
对交联度小的凝胶（G-75至G-200型），流速与柱的直径有关，并在一定的适宜操作压差下有最大的流速。
流速亦受颗粒大小影响，颗粒大时流速较大，但流速大时洗脱峰形状较宽，颗粒小时流速较慢，分离情况较好。
在操作时应根据实际需要，在不影响分离效果的情况下，尽可能使流速不致太慢，以免时间过长。
5、柱的重新填装
由于在洗脱过程中，所有组分一般可全部自柱上洗下，所以装好一次柱管之后，可以反复使用，无须特殊的“再生”处理。
但由于在使用过程中，颗粒可能渐渐沉积压紧，因此在使用一段时间后，流速可能渐渐减低，使一次分析时间拖长很久，这时需要将凝胶倒出，重新填装，或者用反冲方法，使凝胶松动冲起，再行降沉。
有时流速改变是由于柱顶上有灰尘集聚，则需将表面层除去。
由于葡萄糖凝胶为糖类化合物，并且一定要在液相中操作，所以有必要注意防止发霉与生长细菌。
一般可用0.02%的叠氮钠（NaN3）溶液，它极易溶于水，不与蛋白质和糖反应，也不改变他们的层析效果。
也可用0.002%的洗必泰（hibitane）溶液。
在弱酸性溶液中可用0.05%（0.01-0.02%）三氯丁醇溶液，但它在强碱性溶液或加热到60度以上时就要分解。
在弱碱性溶液中也有用0.01%乙醇溶液防腐消毒。
一般不用氯仿、丁醇、甲苯等为防腐剂，因为它们能引起凝胶颗粒的收缩，同时还能进入层析仪器的塑料部件，使塑料变软，造成不良后果。
6、凝胶的保存方法：
凝胶用完后可用以下方法保存：
（1）、膨胀状态：
即在水相中保存，可加入上述防腐剂，或加热灭菌后于低温保存。
（2）、半收缩状态：
用完后用水洗净，然后再用60-70%乙醇洗，则凝胶体积缩小，于低温保存。
（3）、干燥状态：
用水洗净后，加入含乙醇的水洗，并逐渐加大含醇量，最后用95%乙醇洗，则凝胶水收缩，再用乙醚洗去乙醇，抽虑至干，于60-80度干燥后保存。
这三种方法中，以干燥状态保存为最好。
（二）用葡萄糖凝胶层分析法测定蛋白质的分子量：
凝胶层析的操作方法如上所述。
测定蛋白质的分子量根据需要可选用SephadexG-75,G-100或G-150型凝胶凝胶颗粒一般在40-120微米，柱管选用直径1.0-1.3cm，高90-100cm。
1、标准曲线的制定：
层析柱用1X40cm，凝胶用SephadexG-75（或G-100）。
[1]蛋白质标准样品混合液：
分别称取4mg蓝色葡萄糖-2000（分子量200，000）、牛血清蛋白（分子量67，000），胃蛋白酶（分子量36，000），Cytc（分子量：
13，700）共同溶于2mlPH7.50.025mol/LTris-HCl缓冲液中。
[2]上柱和脱洗：
将标准样品混合液上柱，然后用PH7.50.025mol/LTris-HCl溶液洗脱。
用部分收集器收集，3ml/管，紫外检测仪280nm处检测。
或收集后用紫外分光光度计于280nm处测定每管的A值，以管号（或洗脱体积）为横坐标，A值为纵坐标绘出洗脱曲线。
根据洗脱峰位置量出每种蛋白质的洗脱体积（Ve）。
然后以蛋白质分子量的对数（1gM）为横坐标，Ve为纵坐标，作出标准曲线。
2、未知数品分子量的测定：
完全按照标准曲线的条件操作，根据紫外检测的洗脱峰位置，测出洗脱体积。
（三）实验结果与分析
1、洗脱曲线的绘制
以管号（或洗脱体积）为横坐标，A值为纵坐标绘出洗脱曲线如图2
图2凝胶层析柱洗脱示意图
2、洗脱体积表
根据洗脱峰位置可以得出四种蛋白质的洗脱体积（Ve），蓝色葡聚糖-2000=6*3ml=18ml；
牛血清白蛋白Ve=7*3ml=21ml；
胃蛋白酶Ve=8*3ml=24ml；
CytcVe=12*3ml=36ml。
其结果如下表1。
表1四种蛋白质的相对分子质量与洗脱体积
蓝色葡聚糖-2000
牛血清蛋白
胃蛋白酶
Cytc
洗脱体积Ve（ml）
18
21
24
36
相对分子质量
200，000
67,000
36,000
13,700
相对分子质量对数
5.3
4.8
4.6
4.1
3、选择曲线绘制
以表1中蛋白质分子量的对数（lgM）为横坐标，Ve为纵坐标，得出选择曲线如图3。
图3选择曲线
4、结果分析
凝胶层析柱洗脱示意图有较为明显的四个峰值，即在第6管，第10管，第14管，第21管，分别对应的OD值为0.195、0.140、0.119、0.300，再结合标曲，可以看出本实验大体上分离了4种蛋白，没有达到基线分离的效果。
就其原因可能是加样时间间隔不够，洗脱速度稍快或者装柱不够均匀造成的拖尾现象。
从标曲制作结果来看R2=0.8916<
0.99，说明该标曲线性不佳，也间接显示出本次凝胶层析分离效果不佳。
凝胶层析是生化实验中常用的实验，关键影响因素有：
胶的选择和制备，即要求根据不同的分离目标选择不同的合适的分离胶和洗脱液，制备过程中一定要保证胶的充分溶解吸涨。
搅拌时动作要柔和，以免弄破凝胶颗粒和产生气泡。
在装柱时保证柱子的均匀和防止气泡的产生。
在层析过程中，保证一定的流速和电压，使洗脱尽力充分。
5、原始数据记录表，如表2.
表2原始数据记录表
编号
A280
加样顺序
1
0.012
蓝色葡聚糖-2000（200KD）
2
0.005
3
0.006
4
0.003
牛血清白蛋白（67KD）
5
6
0.195
7
0.130
胃蛋白酶（36KD）
8
0.024
9
0.085
10
0.140
CytC（13.7KD）
11
0.067
12
13
0.094
14
0.119
15
0.049
16
0.027
17
0.034
0.016
19
0.061
20
0.235
0.300
22
0.202
23
0.114
0.070
25
0.050
27
0.010
28
0.002
实验二小麦种子储藏蛋白——HMW-GS的分离
一、目的
利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）研究小麦种子储藏蛋白（高分子量麦谷蛋白亚基HMW-GS）组成结果。
此外，SDS-PAGE也是测定蛋白质亚基分子质量的常用方法，通过本实验，掌握SDS-PAGE的基本原理、技术和应用。
二、实验原理
用十二烷基硫酸钠（SDS）和还原剂（巯基乙醇或二硫苏糖醇）热处理蛋白质样品，蛋白质分子中的二硫键被还原，解离的亚基与SDS发生定量结合后使得蛋白质亚基带上大量的负电荷，从而掩盖了蛋白质各种亚基间原有的电荷差异。
亚基的构像均呈长椭圆棒状，各种蛋白质亚基-SDS复合物表现出相等的电荷密度，在电场中的迁移速度仅与亚基分子质量有关。
因此，SDS-PAGE可以用来分离蛋白质亚基并测定其蛋白质亚基的分子质量。
三、实验器材和试剂
1、仪器：
电泳仪、垂直板电泳槽、台式高速离心机、加样枪，烧杯50ml2个、移液管
2、试剂和材料：
（1）70%乙醇。
（2）50%正丙醇（含2%β-巯基乙醇）250ml：
正丙醇125ml，β-巯基乙醇5ml，加水至250ml。
（3）样品提取缓冲液（母液）：
4克SDS，11.5mlH2O，20ml甘油，25mlPH6.8、0.5molTris-Hcl，25mg溴酚蓝。
（4）样品提取液：
27.2ml母液+4.8mlβ-巯基乙醇+64mlH2O。
或母液：
水：
β-巯基乙醇=1：
1：
0.02。
（5）30%丙烯酰胺+甲叉双丙烯酰胺：
丙烯酰胺（Acr）150g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）4g定容至500ml。
（6）分离胶缓冲液（Tris-Hcl）PH8.8：
18.17gTris，用Hcl调PH至8.8定容至1000ml。
（7）浓缩胶缓冲液（Tris-Hcl）PH6.8：
15.1gTris用Hcl调PH至6.8g定容至250ml。
（8）10%SDS（W/V）
（9）10%（W/V）过硫酸胺。
（10）TEMED（四甲基乙二胺），4℃棕色瓶储藏。
（11）电极缓冲液（10X）500ml：
72g甘氨酸，15.15Tris，5gSDS。
（12）染色液：
45%甲醇+45%水+10%冰醋酸+0.02%考马斯亮蓝R250
（13）漂洗剂：
10%甲醇+80%水+10%冰醋酸。
四、实验步骤
1、样品的提取
（1）取一粒种子研磨粉碎成粉状，加入70%乙醇1000ml，10分钟后，12000转离心8分钟，倒掉乙醇并晾干。
（2）加50%正丙醇（含2%β-巯基乙醇）250ml混匀后，50℃水浴1.5小时，中途需要振荡，然后放入12000转离心8分钟。
（3）取上清液加3倍体积丙酮置于-20℃冰箱2小时。
（4）12000转离心8分钟，倒掉丙酮晾干，加样品提取液250ul，待溶解完全后，在沸水浴煮沸3分钟即可，再在12000离心3分钟。
上清液用于点样。
2、SDS—PAGE分析
（1）组装电泳槽：
见电泳槽使用说明书。
（2）凝胶的制备：
取两只干净烧杯（50ml）标号，按下表试剂配方进行配胶。
在配胶前先用分离胶的十分之一封底，保证不能漏胶。
然后再在电泳槽中先置分离胶，待分离胶聚合后，倒掉乙醇溶液，再灌浓缩胶，灌好浓缩胶后迅速插入样品梳静置聚合。
分离胶用量15ml，浓缩胶用量5ml。
表1
凝胶的制备试剂配方
聚丙烯酰胺凝胶组成
分离胶（10%）
浓缩胶（3%）
30%丙烯酰胺（Acr）+甲叉双丙烯酰胺（Bis）ml
2.5
0.62
分离胶缓冲液PH8.8Tris-Hcl（含SDSTEMED）ml
0.2
-
浓缩胶缓冲液PH6.8Tris-Hcl（含SDSTEMED）ml
H2Oml
2.95
10%Ap过硫酸胺ul
100
75
（3）加样及电泳
待凝胶聚合完全后，拔掉电泳梳子。
然后将电泳槽注满电极缓冲液。
取适量10和15ml上清液加样，在标准泳道点上高分子量标准蛋白质溶液。
上槽接负极，下槽接正极，恒流20mA电泳，待溴酚蓝走出分离胶后30分钟停止电泳（约2小时），取出玻璃板,剥胶染色。
（4）染色
剥下的胶用蒸馏水洗涤后加入染色液，盖上盖子，放入微波炉低温染色3分钟，每隔一分钟取出振荡，取出。
（5）脱色
将染色液倒回瓶内，加入漂洗液至背景无色，照相保存。
3、结果处理
量出染料和条带的迁移距离，按下式计算相对迁移率MR
MR=样品迁移距离/染料迁移距离
五、结果与分析
结果如图1
图1SDS-PAGE条带图
条带不是很清晰，可能是在制备凝胶时出现误差。
出现两边翘起中间凹下条带。
其原因是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，这种现象多出现于较厚的凝胶中。
条带出现拖尾现象，其原因主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。
四个样品中有三个条带的位置基本一致，表明四个样品中至少含有三种以上的相同蛋白亚基。
根据不同条带颜色的深浅可以看出不同种类的蛋白亚基的含量是有差别的。
又由不同相对分子量的蛋白亚基的迁移速度不同，可看出各蛋白亚基间的相对分子质量存在较大差异。
实验三
猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定、
同工酶电泳
1概述
SOD（SuperoxideOrgoteinDismutase），别名肝蛋白、奥谷蛋白，是一种含有金属元素的活性蛋白酶，是中国卫生部批准的具有药物功能的物质之一，法定编号为ECl.15
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