微生物实验指导书11Word文件下载.docx
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革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。
实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。
碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。
当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。
革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
（二）实验器材
1．菌种
枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物、金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物、大肠杆菌24h营养琼脂斜面培养物
2．溶液或试剂
香柏油，二甲苯，结晶紫染色液、卢哥氏碘液、95%乙醇、番红染色液，蒸馏水
3．仪器及相关用品
显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、酒精灯、镊子
（三）实验方法
1．显微观察
显微观察时应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序。
油镜观察高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。
在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。
将聚光器升至最高位置并开足光圈，若所用聚光器的数值孔径值超过1.0，还应在聚光镜与载玻片之间也加滴香柏油，保证其达到最大的效能。
调节照明使视野亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。
2．革兰氏染色
（1）
涂片
常规涂片法
取一洁净的载玻片，用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥、固定。
玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。
（2）
初染
滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）于两个玻片的涂面上，染色1～2min
，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。
（3）
媒染
用卢戈氏碘液媒染约1
min
，水洗。
（4）
脱色
用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。
革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。
脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。
脱色时间一般约20～30s。
（5）
复染
在涂片上滴加番红液复染约2～3min
，水洗，然后用吸水纸吸干。
在染色的过程中，不可使染液干涸。
（6）
镜检
干燥后，用油镜观察。
判断两种菌体染色反应性。
菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。
4．用毕后的处理
（1）上升镜筒，取下载玻片。
（2）用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。
（3）用擦镜纸清洁其他物镜及目镜；
用绸布清洁显微镜的金属部件。
（4）分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，再向下旋。
同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。
染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗，凉干后备用。
（四）实验结果
1．绘出你在油镜下观察到的三种菌的形态
2．列表简述两株细菌的染色结果（菌的形状、颜色和革兰氏染色反应）。
（五）思考题
1、用油镜观察时应注意哪些问题？
在载玻片和镜头之间加滴什么油？
起什么作用？
2、影响显微镜分辨率的因素有哪些？
3、
进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题?
4、
你认为制备细菌染色标本时，应该注意哪些环节?
实验二沉降法检测空气中微生物数量
1．学习并掌握用沉降法检测空气中的微生物
2．了解空气中微生物的分布状况
（二）实验原理
在我们周围的环境中存在着种类繁多、数量庞大的微生物。
空气中也不例外。
虽然空气不是微生物栖息的良好环境。
但由于气流、灰尘和水沫的流动，人和动物的活动等原因，仍有相当数量的微生物存在。
当空气中个体微小的微生物落到适合于它们生长繁殖的固体培养基的表面时，在适温下培养一段时间后，每一个分散的菌体或孢子就会形成一个个肉眼可见的细胞群体即菌落。
观察大小、形态各异的菌落，就可大致鉴别空气个存在的微生物的种类。
（三）实验器材
1．试剂
牛肉蛋白胨培养基配方：
牛肉膏5.0g,蛋白胨10.0g，NaCl5g,水1000ml，pH7.2~7.4
马铃薯培养基配方：
马铃薯200g,蔗糖20g,水1000ml，pH7.2
高氏一号培养基配方：
淀粉20g,硝酸钾1.0g,磷酸氢二钾0.5g,硫酸镁0.5g,氯化钠0.5g,硫酸亚铁0.01g,水1000ml,pH7.2~7.4
2.仪器及其他用品
高压灭菌锅，操作工作台，三角瓶，培养皿，酒精灯，培养箱等
（四）实验方法
1．倒平板：
按常法配置上述培养基，分装于三角瓶中，高压灭菌备用。
临用前将培养基熔化，冷却至50℃左右，各倒16个平板备用。
2．暴露取样
在指定的地点草地，一层楼，三层楼，七层楼各放4皿，将平板皿盖打开，在空气中暴露5min和10min,时间一到，立即合上皿盖。
3．培养观察：
细菌置于37℃培养，放线菌培养基平板和真菌培养基平板置于28℃培养。
细菌培养48h，真菌和放线菌培养4-6天。
计数平板上的菌落，观察各种菌落的形态、大小、颜色等特征。
4.计算1m3空气中微生物的数目
奥梅染斯基（Омелянский）曾建议：
如面积为100㎝2的平板培养基，暴露在空气中5分钟，置于37℃培养24小时后所生长的菌落数，相当于10L空气中的细菌数。
X=
X：
每m3空气中的细菌数
N：
平板暴露5分钟，置37℃培养24小时后生长的菌落数
r：
平皿底半径（㎝）
（五）实验结果
1．列表比较不同放置地点空气菌落种类以及数量的差异？
菌落平均数
环境
细菌
霉菌
放线菌
室外
5min
10min
室内
2．用沉降法计算1m3空气环境中所含菌数。
（六）思考题
1．对沉降测定法的结果，进行分析。
实验三多管发酵法检测水中的大肠菌群
1.了解饮用水和水源水大肠菌群的原理和意义
2．学习检测水中大肠菌群的方法
（二）实验原理
大肠菌群是评价水质好坏的一个重要的卫生指标，也是反映水体被生活污水污染的一项重要监测项目。
大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌（Escherichia coli）为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48小时内发酵乳糖并产酸产气。
我国生活饮用水卫生标准中规定一升水样中总大肠菌群数不超过三个。
多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。
乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。
1．初发酵试验
水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。
48小时后仍不产气的为阴性结果。
2．平板分离
初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基，Endo′smedium）或伊红美蓝琼脂（eosinmethyleneblueagar,EMBagar）平板上划线分离菌落。
3．复发酵试验
以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。
原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
1.水样
自来水
2．试剂
乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝或复红亚硫酸钠琼脂平板，革兰氏染液。
3．仪器及其它用品
载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭菌试管，革兰氏染液，显微镜，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，灭菌三角瓶等。
（四）实验方法
1．水样的采取
水源水
2．初发酵试验
取16支发酵管，其中10支用移液管加入10ml一倍的乳酸蛋白胨培养液，5支加入5ml三倍乳糖蛋白胨培养液，1支加入9ml自然水。
完成后包装好，于121℃高压灭菌锅中灭菌30min左右。
冷却后，在无菌操作条件下，向装有三倍的乳酸蛋白胨培养液的5支试管加入10ml水样，向装有一倍的乳糖蛋白胨培养液的5支试管中加入1ml水样，向装有一倍的乳
酸蛋白胨培养液的另5支试管中加入1ml10-1水样。
将各试管充分混均，置于37℃恒温箱中培养24h。
（2）平板分离经24小时培养后，将产酸产气及48小时产酸产气的发酵管（瓶）液体，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再置于37℃下培养18—24小时，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。
（a）深紫黑色、有金属光泽。
（b）紫黑色、不带或略带金属光泽。
（c）淡紫红色、中心颜色较深。
（3）复发酵试验经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1—3个，37℃培养24小时，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。
证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表，即得大肠菌群数。
表1大肠杆菌群的最可能数（MPN单位：
个·
（100ml）-1
出现阳性份数
每100ml水样中细菌的最可能数
95%可信限度值
10ml
管
1ml
管
0.1ml
下限
上限
<
2
4
1
26
9
78
0.5
7
3
27
80
33
11
93
34
12
5
23
70
89
43
15
110
6
46
16
120
13
63
21
150
`17
49
17
130
170
94
28
220
79
25
190
31
250
8
19
140
37
310
180
44
500
35
300
14
57
700
280
90
850
350
1000
240
68
750
540
1400
920
3200
1600
640
5800
22
67
≧2400
水样总量：
55.5ml（5管10ml水样，5管0.1ml水样，5管0.11:
10稀释水样时，不同阳性和阴性情况下100ml水样中细菌的最可能数和95%可信限度值）
1．查表1得每升水源水样中大肠菌群数是多少？
（六）思考题
1．为什么要选择大肠菌群作为水源被肠道病原菌污染的指示菌？
实验四活性污泥中生物相与放线菌、霉菌、酵母菌的形态观察
1．学习观察活性污泥中生物相的方法。
2．初步分析生物处理系统工作状态是否正常。
3.学习并掌握放线菌、霉菌、酵母菌形态结构的方法。
4．加深理解放线菌、霉菌、酵母菌形态结构特征
1．活性污泥中生物相比较复杂，以细菌、原生动物为主，还有真菌、后生动物等。
某些细菌能分泌胶粘物质形成菌胶团，进而组成污泥絮绒体（绒粒）。
在正常的成熟污泥中，细菌大多集于菌胶团絮绒体中，游离细菌较少，此时，污泥絮绒体可具有一定形状、结构稠密、扩光率强、沉降性能好。
原生动物常作为污水净化指标；
当固着型纤毛虫优势时，一般认为污水处理池运转失常。
当后生动物轮虫等大量出现时，意味着污泥极度衰老。
2．放线菌在固体培养基上呈辐射状生长而得名。
放线菌是由不同长短的纤细的菌丝所形成的单细胞菌丝体。
菌丝体分为两部分，即潜入培养基中的营养菌丝（或称基内菌丝）和生长在培养基表面的气生菌丝。
有些气生菌丝分化成各种孢子丝，呈螺旋形、波浪形或分枝状等。
孢子常呈圆形、椭圆形或杆形。
气生菌丝及孢子的形状和颜色常作为分类的重要依据。
3.霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，而且孢子很容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。
此染色液制成的霉菌标本片其特点是（a）细胞不变形；
（b）具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间；
（c）溶液本身呈蓝色，有一定染色效果。
霉菌的菌丝、分生孢子梗和分生孢子的形态常作为分类的重要依据。
4.酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显的分化，菌体比细菌大。
繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；
有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。
本实验通过用美蓝染色浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。
美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对酵母的活细胞进行染色，由于细胞中新陈代谢的作用。
使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。
因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。
1．活性污泥样品
2．菌种
放线菌、霉菌、酵母菌
3.试剂
0.1%吕氏碱性美蓝染液
4．仪器以及其它用品
显微镜，目镜测微尺，200ml量筒、载玻片、盖玻片、玻璃小吸管、橡皮吸头、镊子。
吸水纸，香柏油，二甲苯
1．活性污泥生物相的观察
（1）肉眼观察：
取曝气池的混合液置于100ml量筒内，直观活性污泥在量筒中呈现的絮绒体外观及沉降性能（30分钟沉降后的污泥体积）。
（2）制片镜检：
滴混合液1—2滴于载玻片上，加盖玻片制成水浸标本片，在显微镜中倍或高倍镜下观察生物相。
丝状微生物：
伸出絮绒体外的多寡，以哪一类为优势？
见本实验附注1。
微型动物：
原生动物的识别。
常见后生动物特征描述见本实验附注2。
2.放线菌的观察
直接观察法
用镊子连同培养基挑取放线菌菌苔置载玻片中央。
放在洁净的载玻片上，选择菌苔边缘部位，在显微镜下依次用低倍镜、中倍镜、高倍镜直接观察，观察时需不断调节微调，仔细观察气生菌丝，基内菌丝和孢子丝的形状。
插片观察法
将高氏1号培养基倒入无菌培养皿，制成4㎜左右的培养基平板，经培养检验后无菌，备用。
然后将孢子悬液涂皿（浓度以稀释10-2—10-3为好）。
用火焰灭菌的镊子将无菌盖玻片以45度倾斜角插入平皿培养基琼脂内，倒置，于28℃培养4—5天后，小心地将盖玻片取出，把有菌的一面朝上，放在载玻片上，置显微镜下进行观察。
一般情况是气生菌丝颜色较深，并比营养菌丝粗二倍左右。
3．霉菌的观察
放在洁净的载玻片上，选择菌苔边缘部位，在显微镜下依次用低倍镜、中倍镜、高倍镜直接观察，观察时需不断调节微调，仔细观察菌丝，分生孢子梗和分生孢子。
4.酵母菌的观察
（1）在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染液，液滴不可过多或过少，以免盖上盖玻片时，溢出或留有气泡。
然后按无菌操作法取在琼脂斜面上培养48小时的酵母菌少许，放在吕氏碱性美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合。
（2）用镊子夹盖玻片一块，小心地盖在液滴上。
盖盖玻片时应注意，不能将盖玻片平放下去，应先将盖玻片的一边与液滴接触，然后将整个盖玻片慢慢放下，这样可以避免产生气泡。
（3）将制好的水浸片放置3分钟后镜检。
先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。
（4）染色半小时后，再观察一下死细胞数是否增加。
（5）用0.05%吕氏碱性美蓝染液重复上述的操作。
1．将镜检结果填于下表中，并列出所见主要生物。
活性污泥来源，采样日期
丝状
微生物
原生动物
后生动物
3．绘图说明你所观察到的放线菌、酶菌以及酵母菌的形态特征。
1．根据实验观察情况，试对活性污泥质量及运行情况作初步评价。
2.在自然界和实际应用中放线菌有什么作用？
（七）附录
1．活性污泥中常见的丝状微生物
（1）球衣菌（Sphaerotilus）：
由许多圆柱形细胞排列成链，外面包围一层衣鞘，形成丝状体。
具有假分枝。
单个菌体可自衣鞘游出，活泼运动或粘附于鞘外。
（2）贝氏硫菌（Beggiatoa）：
无色而宽度均匀的丝状体，与球衣菌不同的是外面无衣鞘，各丝状体分散不相连接。
丝状体由圆柱形细胞紧密排列而成，有时可见硫粒。
丝状体不固着于基质上，可呈匍匐状滑行，菌体扭曲、穿插匍匐滑行于污泥之中。
（3）发硫菌（Thiothrix）：
亦由细胞排列成丝状体，具薄鞘但一般镜检时不可见。
其丝状体基部有吸盘，可使菌体固着于基质上生长。
在附着生长时，有时菌丝体左右平等伸长成羽毛状，有时以放射状从活性污泥絮绒体内向四周伸展，有时菌丝体交织在一起自成中心向四周伸展。
（4）霉菌（mould）：
活性污泥中常见到菌丝体远较上述细菌为粗大的霉菌菌丝体和霉菌孢子。
菌丝体有的有隔，并具有真分枝。
2．活性污泥中常见的后生动物
（1）线虫（Nematoda）：
身体细长呈线形，其横切面呈圆形。
常见卷曲不能自由伸缩，而是靠身体作蛇形扭曲而运动。
（2）轮虫（Rotifer
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