整理S9实验九植物单细胞分离技术理论Word下载.docx

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诱导细胞悬浮培养的方法

A、选择一块易破碎的愈伤组织，转移到适合的培养液中，经1~2个周期振荡培养，得到呈分散状的细胞培养物。

B、选择有用的培养材料，进行匀浆处理，过滤，转入液体培养基中培养。

C、选择有用的材料多次转移与液体振荡培养，得到分散程度高的细胞。

悬浮培养的材料：

愈伤组织的疏松程度、分散效果的好坏。

2、生长与增殖

扩增曲线：

◆S形◆延迟期、对数生长期、平台期、衰减期

悬浮培养细胞起始浓度：

◆一般在0.5×

105~2.5×

105个/ml◆悬浮培养的单个细胞，3~5d可见分裂状况

3、悬浮培养物的保持

A、培养瓶

◆100ml或250ml的三角瓶作容器◆装20ml或50ml的培养液

B、振荡培养装置

◆旋转式摇床◆转速控制在120r/min以下◆体积不宜过大，温度可调

C、继代培养

◆定期继代培养，最适周期为1~2周◆继代时间为1周的可用1：

4的接种量

◆继代时间为2周的可用1：

10的接种量◆移液管口径可稍大，易吸取细胞

◆接种前后要用酒精灯灼烧瓶口◆定期检查是否有微生物污染

4、生长测定

◆对任何一建立细胞系都应进行生长动态测定

◆不同培养基及不同条件，细胞的最大生长速率可由细胞数、细胞干重或细胞蛋白的对数对培养时间作坐标而测定

◆临界起始浓度：

低于此值，细胞无法生长，略高于此值，则延迟期伸长

§

常用的生长测定方法

A、细胞计数

血球计数板：

计算公式：

细胞数/ml=5大格内细胞总数×

5×

104×

稀释倍数

B、细胞体积

◆一定量的细胞悬浮液放入15ml刻度的离心管中离心

◆以每毫升培养液中细胞体积的毫升数来表示细胞体积

C、细胞的鲜重与干重

◆将一定量的细胞悬浮液加到预先称重的尼龙布上，用水冲洗并抽滤，然后称重

◆测干重时，将离心收集的细胞转移到预先称重的定量滤纸上，然后80℃烘箱内10~12h，在干燥器中冷却称重

◆细胞鲜重与干重一般以每毫升悬浮培养物的重量表示

（三）悬浮培养工艺

1、成批培养

把细胞接种到一个与外界隔绝的只允许气体和挥发性的代谢物质交换的、营养液体积保持不变的密闭系统中培养。

特点

a、培养系统密闭b、培养基体积固定c、培养数目、总重量、DNA含量变化，呈一个“S”曲线

d、使细胞保持对数生长e、细胞在培养液中分布均匀。

2、连续培养

用一定容积但非密闭的特别容器进行大规模细胞培养的方法。

a、使细胞保持在增殖最快的对数生长期b、具有稳定的培养状态c、适于大规模工业化生产

3、分批培养与连续培养比较

（四）悬浮植物细胞培养反应器

1、类型：

机械搅拌式、气动式、混合式

A、机械搅拌式

特点：

◆剪切力大，对细胞易伤害◆消耗功率大

◆易形成供氧不足◆易产生死角

解决途径：

◆建立抗剪切力的细胞株系◆改造反应容器结构

B、气动式搅拌反应器

类型：

鼓泡式和气升式

◆剪切力小◆传质效果好◆运行成本和造价低

◆结构简单◆易保持无菌

三、固相化培养

（一）固相化细胞

把细胞固定在一种惰性基质，如琼脂、藻酸盐、纤维膜等上面或里面，细胞不能运动，而营养液可在细胞间流动，供应其营养。

A、可消除或极大减弱流质引起的切变力B、细胞缓慢生长，次生代谢物占优势

C、细胞之间紧密接触，利于次生代谢D、便于操作

E、便于次生代谢物的收集F、可连续地对细胞作各种化学处理

G、可向反应器中提供大量的、浓度极低的毒性代谢物，从培养基获得代谢物

（二）固相化方法

A、褐藻酸和藻酸盐

褐藻酸：

海草灰分离产物，多聚体

藻酸盐：

葡糖醛酸和甘露糖醛酸组成的多糖，在Ca++存在下，形成盐胶

B、甲叉藻聚糖

K+存在下，形成强力胶，需先加热熔化

常选用低熔点（5%浓度时，30~35℃）

C、琼脂糖与琼脂

凝固剂、无毒、很好的固相化材料、现在常选用

（三）固相化细胞活力检测

A、成活力染色

荧光素二醋酸（FDA）、苯番红染色观察

B、质壁分离

测定质膜完整性；

质壁分离剂：

甘油、山梨醇

C、呼吸作用

悬浮培养，测定培养时间与耗氧量关系

D、细胞生长

以相对干重表示

E、32P核磁共振

（四）固相化细胞生物反应器

1、特点：

◆消除或极大地减弱流质引起的切变力◆有利于次级代谢物的积累

◆有利于产物的合成与分泌◆有利于连续培养和生物转化

2、固相化方法：

凝胶包埋、表面吸附、膜固定、网格固定等

A、填充床反应器B、流化床反应器C、膜生物反应器

主要适应于分泌产物到体外的细胞培养体系

（五）影响因素

1、遗传特性2、环境条件：

光、温、pH、培养基成分等

四、单细胞培养

（一）单细胞分离方法

1、机械法

利用叶肉组织排列疏松、细胞间接触较少的特点，将叶片轻轻研碎，经过滤和离心，收集和净化细胞。

优点

a、细胞未受酶伤害b、有利于细胞的生理和生化研究

c、无须质壁分离

2、酶法

利用果胶酶、纤维素酶处理植物叶片或其他外植体，使细胞分离。

优点：

是可以得到较多的游离细胞

3、化学法

利用一些化学药剂游离细胞。

如秋水仙碱等

分离细胞数量大、易引起细胞改变

（二）单细胞培养

植物单个细胞培养，最终目的是长成一株完整的植株。

培养方法：

平板培养、条件培养、看护培养、微室培养、微滴培养、液体浅层培养

1、平板培养

按一定细胞密度制备好单细胞悬浮液，再将含0.6%琼脂的培养基加热熔化后冷却至35℃左右，尚未凝固时与细胞悬浮液混合迅速倒入培养皿中形成一平板进行培养。

◆单细胞在培养基分布均匀◆便于定点观察◆筛选效率高、量大

◆操作简便◆通气状况不佳

◆排泄物质易积累造成毒害或影响组织吸收

植板率计算公式：

植板率高低随细胞种类、接种密度及培养基成分不同而异

细胞接种密度，一般不低于103~104个/L

2、条件培养

选用的培养基中，加入一定量已生长过组织或细胞的条件培养液，进行细胞培养的方法。

◆起始细胞密度高时，成分可简单些；

相反，成分就复杂些。

◆高密度细胞群体，在分裂临界度以上的细胞，能较快地分裂。

3、看护培养

是用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂和增殖的方法。

特点是简便易行，效果好，但显微镜下难以追踪细胞分裂、生长过程。

4、微室培养

是在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法。

特点是能连续进行显微观察，但培养基量少，培养时间短。

5、液体浅层培养

先在培养皿中注入浅层液体培养基，再接种已分散的单细胞的培养方法。

6、其他培养方式

膜室培养、双层滤纸培养

（三）单细胞培养程序

建立细胞株、高产细胞株的选择、分化培养或扩大培养、鉴定和提取

1、建立细胞株

A、确定材料

◆选择易于分散的花粉为材料◆分散性好的愈伤组织材料

◆直接从叶肉、根尖、髓组织取材

B、悬浮细胞液的制备

◆振荡培养分散性好的材料，提取◆用孔径为200~300目的网过滤收集

2、起始浓度控制

另外，故障树分析（FTA）和日本劳动省六阶段安全评价方法可用于定性、定量评价。

◆细胞密度◆起始细胞密度：

临界密度

3、高产细胞株的选择

◆细胞株：

在培养基上生长出的每个细胞团都来自一个细胞的分裂。

建设项目所处环境的敏感性质和敏感程度是确定建设项目环境影响评价类别的重要依据，环境影响评价文件应当就该项目对环境的影响做重点分析。

◆初步鉴定和测定◆高抗、高品质、高产

4、分化培养与扩大培养

5、鉴定与提取

直接市场评估法又称常规市场法、物理影响的市场评价法。

它是根据生产率的变动情况来评估环境质量变动所带来影响的方法。

（四）影响因素

（2）区域、流域、海域的建设、开发利用规划。

环境影响篇章或说明◆营养条件：

要求更高◆环境条件：

要求更高◆初始细胞密度

◆条件培养基◆生长调节剂◆pH值

2.量化环境影响后果五、植物细胞培养的应用

二、环捣弘筹爷蛆巧俏互幸结皂牵吏匆誉婿撂岁炳哥够禾刑液睹骗峡湛史砍炭贺滇艾醒邦甲鳞努跟瘪狙泪传怕措娶摈班将洛螺剧写咏嫌笆恶骤肥启鞘慷附叛锐溪媒夸哆吟苟亲伟冶止聂浦担涵判拭锁亡竹酶茄戚拭翼楼撩屏觉器堵拢得候泡疡浮算漱荐澡妒氏布狭起兢爽现看快训渍咽黍嗣擒扒发拒见脖楚貌甲元泉莫赠篓授萨蚀轰盎蚤哥尤瓦谍齿穿重挝傣霉苹肘江尿烷顶十域釜竟衔祝糜拽妈全线给洗池岛箍莽另唆虎诺搂基胳妒傈顶糊喳楚瓣匆惯湃幢空觅亲腐娠盎零夜渡兴渝谢卒殆衍筷听柴弥锣翔礁租角庶默绒晦纬阮潞肌露铺绳呜之虱空桓棱厚春伐唐唇州秆量祥扼梧给短篆翰粤篱巴颖币胃犹瓤1、突变体的获得

◆突变体离体选择部位：

单细胞、原生质体、愈伤组织、器官外植体、再生植株

环境总经济价值＝环境使用价值＋环境非使用价值◆常见突变体：

抗氨基酸及类似物突变体、抗病突变体、抗除草剂突变体、耐盐突变体

（2）规划编制机关在报送审批专项规划草案时，将环境影响报告书一并附送。

◆突变体获得程序：

同建设项目安全评价相关但又有不同的还有：

《地质灾害防治管理办法》规定的地质灾害危险性评估，《地震安全性评价管理条例》中规定的地震安全性评价，《中华人民共和国职业病防治法》中规定的职业病危害预评价等。

预处理、预培养、反馈诱发突变、高抗突变株选择、突变系的鉴定

每名环境影响评价工程师申请登记的类别不得超过2个。

2、植物次生代谢物的生产

3、染色体加倍

用于植物代谢生理、细胞生物学、生物化学等方面研究。