DC与CIK共培养对肝癌细胞杀伤活性的研究Word格式.docx

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　　KillingActivityinDCandCIKCo-cultureagainstHepatocar-cinomaCells

　　AbstractThisstudywasaimedtoinvestigatetheproliferationactivitiesandphenotypechangesofDC，CIKandDC-CIK，andtheircytotoxicityagainsthepatocarcinomacellsinco-cultureofDCwithCIK.Peripheralbloodmononuclearcells（PBMNC）wereisolatedfromheathyadultdonors.AfterincubationofPBMNCfor2hours，DCswereinducedfromadherentcellsbysomecytokinesandCIKsweregeneratedfromnon-adherentcells.MatureDCswereharvestedafterincubationfor9days，andthenwereco-culturedwithCIKatratioof1:

5for3days.ThecytotoxicityactivityagainstSMMC-7721hepatocellularcarcinomacelllinewasdetectedbyMTTassay.TheresultsshowedthatCIKcellswereabletolyseSMMC-7721hepatocellularcarcinomacellsatlowratiosofeffectortotarget.Thiseffectwassignificantlyenhancedbyco-culturewithDCs.ItisconcludedthatCIKcellshavehighlyticactivityagainst7721hepatocellularcarcinomacellline，whichcanbeenhancedbyco-culturewithDC.DC-CIKcellsarehighlyeffectiveimmunecells.

　　KeywordDendriticcells;

cytokineinducedkillercells;

Immunetherapy

　　近年来随着细胞免疫学和分子生物学的发展，恶性肿瘤的细胞免疫治疗已经开始在临床应用，并取得一定疗效。

细胞因子诱导的杀伤细胞是一种高效、新型免疫活性细胞，是恶性肿瘤过继免疫治疗的重要手段之一。

树突状细胞是目前发现的功能最强的抗原呈递细胞，它通过处理、呈递抗原，介导机体免疫应答。

由于许多肿瘤宿主缺乏功能性DC而不能诱发抗原特异性T细胞应答，故在体外诱导功能性DC用于主动免疫治疗具有重要的临床应用价值。

本实验将成熟DC和CIK细胞共培养，观察DC-CIK细胞群的增殖活性和表型变化，及其对肝癌细胞的体外杀伤作用。

　　材料和方法

　　主要试剂和仪器

　　IMDM完全培养基为Gibco公司产品，10%AB灭活血清为南京红十字血液中心产品，AIM-V无血清培养基为Gibco公司产品，淋巴细胞分离液购自上海第二制药厂，CD3单克隆抗体购自OrthoBiotech公司，IFN-α1b购自上海生物制品研究所，rhIL-2购自Chiron公司，rhGM-CSF，rhIL-1β，rhIL-4，rhIL-6，TNF-α和PGE-2均购自PEPROTech公司，MTT购自R＆DSystems公司）。

正常人外周血取于4名健康供者。

肝癌细胞株SMMC-7721为本实验室液氮保存株。

流式细胞仪为美国BectonDickinson公司产品，透射电镜为HITACHI公司产品。

　　CIK细胞的体外诱导和扩增

　　通过血细胞分离机从健康供者采集外周血单个核细胞，用淋巴细胞分离液分离出MNC，用AIM-V无血清培养基调细胞浓度为×

106/ml，置于37℃、5%CO2培养箱培养2小时。

收集非贴壁细胞，用含10%人AB血清的IMDM调细胞浓度为×

106/ml，并加入1000U/ml的IFN-α悬浮培养，24小时后加入1μg/ml的CD3单克隆抗体和1000U/ml的rhIL-2，每隔3天半量换液1次，补充rhIL-2，调整细胞浓度始终为×

106/ml。

　　DC的体外培养

　　在PBMNC培养2小时之后的贴壁细胞中，加入含1000U/ml的GM-CSF和1000U/ml的IL-4的AIM-V培养液，37℃、5%CO2培养箱培养。

每3天换液1次并补充细胞因子，第6天加入上述细胞因子的同时还加入IL-1β、TNF-α、PGE-2等细胞因子诱导DC成熟，共培养8-9天。

　　DC与CIK细胞共培养

　　收获的DC计数后和CIK按1∶5混合培养，共培养3天。

　　CIK及DC-CIK对肿瘤细胞的细胞毒作用的MTT测定

　　以培养12天的CIK、DC-CIK共培养物作为效应细胞，SMMC-7721肝癌细胞株为靶细胞。

取对数生长期7721肝癌细胞，调整浓度为1×

105/ml，CIK、DC-CIK的细胞浓度分别调整为×

105/ml、5×

105/ml、1×

106/ml、2×

106/ml，效靶比依次为为∶1、5∶1、10∶1、20∶1，实验分3组，每组3个复孔，实验组加效、靶细胞各100μl/well，靶细胞组加入靶细胞、IMDM培养液各100μl/well，效应细胞组加入效应细胞、IMDM培养液各100μl/well，置37℃、5%CO2培养箱中孵育24小时，加入MTT试剂20μl/well37℃孵育4小时，再加入detergentreagent100μl/well37℃孵育2小时，待充分溶解沉淀后于酶联免疫检测仪检测吸光度，计算杀伤率。

计算公式为

　　杀伤率=［1-］×

100%

　　CIK、DC、DC-CIK细胞群表型检测

　　在DC培养的第9天用流式细胞仪进行免疫表型分析，在CIK细胞培养的第9、14、21天分别取少量细胞进行流式细胞术测定，DC-CIK共培养物共培养3天后进行流式细胞术测定。

　　DC透射电镜观察

　　将诱导培养至第9天的DC收获，取1×

106个细胞悬液，离心，细胞沉淀用%戊二醛及%的锇酸固定，经乙醇梯度脱水，超薄切片铅铀染色后置透射电镜下观察。

　　统计学处理

　　采用SAS软件进行t检验。

　　结果

　　细胞的增殖情况及形态观察

　　CIK和DC-CIK的增殖活性

　　培养细胞在第3天开始出现增殖，第5天以后进入快速增殖期。

DC-CIK共培养3天后，增殖速度明显快于单纯CIK细胞组，培养第17天时两者增殖倍数相差1倍多。

倒置显微镜下可见细胞呈集落样悬浮生长，细胞体积明显增大，培养期内细胞存活率均95%以上。

　　DC的增殖

　　培养的第2-3天细胞开始出现变形，拉长呈梭形、细树枝状及放射状等各种不规则形态，部分细胞开始悬浮，贴壁细胞部分聚集成团；

培养5-6天后，集落明显增多，且有

　　CIK细胞是一种非MHC限制性的高效溶肿瘤细胞毒性T细胞，其在外周血淋巴细胞中的比例为1%-5%。

1991年，Schmidt-wolf［1］等首先报道了CIK细胞。

CIK细胞是人外周血单个核细胞在体外经多种细胞因子刺激后获得的一群异质性细胞，其主要效应细胞表面既有T细胞表面标志，也有NK细胞表面标志，因而兼有T淋巴细胞抗瘤活性和NK细胞非MHC限制性杀瘤的特点。

应用CIK细胞治疗克服了过去过继免疫疗法的不足，如体外增殖数量少、需输注IL-2、低效及副作用大等，现已经成为肿瘤生物治疗的一种新方法。

树突状细胞是机体内最重要的、功能最强的抗原呈递细胞，最初是Steinman和Cohn等于1973年从小鼠脾组织中分离发现的。

DC最大的特点是能激活初始型T细胞增殖并建立初级免疫应答；

DC激发T细胞增殖及抗原呈递能力是巨噬细胞和B细胞的100-1000倍［2］。

以外周血单核细胞为DC前体细胞诱导DC，是体外大量生成DC的一条重要途径。

GM-CSF可促进髓系细胞发育，是生成和维持DC发育和分化的最根本的细胞因子［3］；

IL-4抑制粒细胞和巨噬细胞产生，促进单核细胞向DC的转化，并维持DC成熟；

TNF-α和PGE2可阻止粒系的分化而刺激DC的成熟并增强其抗原呈递能力［4］。

Marten等［5］将CIK和同源DC共培养后发现，DC分泌IL-12明显增加，并使CIK细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性明显增强。

阻断IL-12对CIK细胞的作用，可以使CIK杀伤活性明显减低。

我们的实验研究表明，DC-CIK细胞群比同源CIK细胞具有更强的增殖活性，共培养1周后DC-CIK的扩增倍数比同源CIK高约1倍。

Zoll等［6］的研究表明，IL-2和IL-12对CIK细胞有促增殖作用，且IL-12使CIK细胞高表达对杀瘤活性起重要作用的CD56+细胞。

成熟DC自身可分泌高水平的IL-2、IL-12和IFN-γ等细胞因子，因此与CIK细胞共培养后可提高CIK的增殖活性和细胞毒作用，这对于肿瘤临床具有重要意义。

DC与CIK共培养过程中，CIK细胞中CD3+CD8+、CD3+CD56+的比例较单纯CIK细胞有不同程度的增高，说明大量成熟DC进一步促进了CIK细胞的成熟。

目前关于CIK杀伤靶细胞的原理尚未完全阐明，可能是通过黏附因子LFA/ICAM-1途径与肿瘤细胞结合后，分泌含大量BLT酯酶的颗粒，这些颗粒能穿透靶细胞膜，导致肿瘤细胞的裂解［7］；

而且CIK细胞还能分泌IL-2，IL-6，TNF-α及GM-CSF等一些细胞因子，增强细胞毒作用；

此外，CIK细胞还可通过直接靶向肿瘤细胞进行杀伤或诱导其凋亡。

DC能进一步提高CIK对靶细胞的杀伤活性，其机制可能为：

①DC能分泌多种细胞因子，如IL-2、IL-12、IFN-γ等，促进CIK成熟；

②DC分泌高水平的IL-12，诱导Th1型免疫应答，有利于清除肿瘤细胞［8］。

因此，在今后的肿瘤临床治疗中，用DC-CIK回输治疗要优于直接CIK治疗或DC治疗。

因为，DC和CIK同时回输，已活化的CIK可以直接杀伤肿瘤细胞，而DC可继续活化体内的T细胞，从而发挥较持久的抗肿瘤作用。

本研究表明，DC-CIK共培养能提高CIK对SMMC-7721肝癌细胞的杀伤活性，其杀瘤作用较单纯CIK细胞更强。

本研究为DC-CIK应用于肝癌临床治疗提供了可靠的依据，是将主动特异性免疫治疗和过继免疫治疗相结合产生更有效的肿瘤免疫治疗方法的新的探索。

【参考文献】

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