医院病理科分子病理实验室实施方案Word格式文档下载.docx

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应用PCR-RFLP方法检测结肠癌患者粪便中的Ras基因突变，其检出率与瘤组织中相似，可用于高危人群的筛选。

4、疑难肿瘤的诊断和分类：

传统的病理学诊断主要通过形态学和免疫表型来判断淋巴细胞增生与淋巴细胞性肿瘤，但对对医生的经验要求较高，且难度较大。

应用RFLP分析免疫球蛋白或T细胞受体基因重排，具有鉴别诊断作用，且这种分子病理分型比免疫学分型更为准确。

对Bcr区基因重排的检测，可对慢性粒细胞性白血病和急性粒细胞性白血病进行鉴别诊断。

N-myc和C-myc扩增和表达的检测，对鉴别神经母细胞瘤和神经上皮瘤具有应用价值，因前者N-myc明显扩增，而后者则为C-myc明显扩增。

5、肿瘤的预后监测：

利用癌症患者的全基因序列开发出的个性化血液检测方法有助于医生调整癌症患者的治疗方案，可以监测癌症治疗后的情况以及发现癌症是否复发。

6、为肿瘤个体化和预见性治疗提供依据：

肿瘤在发生、发展的不同时期，可能涉及不同基因的不同变化形式，而这种变化与肿瘤临床治疗的敏感性密切相关，如能在分子水平对肿瘤基因变化提供指标，对肿瘤的个体化和预见性治疗具有指导意义。

如在90%的胰腺癌、50%的结肠癌、30%的非小细胞肺癌中存在Ras基因的激活，50%左右的肿瘤有P53基因不同形式的突变，这些基因的异常，使肿瘤对某些放疗或化疗的方法具有抵抗性，如能从基因水平上改变异常基因的状态，则可提高放、化疗的敏感性。

7、肿瘤的预后判断：

肿瘤基因的突变、扩增及过表达等改变常与肿瘤的预后密切相关。

如HER2基因扩增与乳腺癌发生发展及临床预后密切相关,HER2的阳性表达提示预后不良，可通过荧光原位杂交（FISH）技术进行检测，配合术后治疗，指导临床用药。

1.1分子病理诊断的应用范围

⏹人类遗传病的基因诊断和产前诊断

⏹肿瘤分子靶向治疗

⏹明确感染性疾病的病源体（细胞、真菌、病毒）

⏹多基因病研究

⏹组织器官移植配型

⏹辅助病理诊断

⏹法医学

⏹性别鉴定

⏹基础研究

◆通过PCR技术确认Ig和TCR基因是否发生重排，判定淋巴造血系统疾病的良恶性。

◆FISH法检测乳腺癌her-2基因是否发生扩增，指导临床靶向药物（赫赛汀）治疗。

◆FISH法检测滑膜肉瘤SYT基因是否发生易位，协助临床诊断。

◆通过对结直肠癌KRAS基因的突变测序分析，指导靶向用药（爱比妥）。

◆HPV多亚型检测，提示宫颈癌的发病风险。

◆肺癌分子靶向治疗EGFR酪氨酸激酶抑制剂：

吉非替尼（gefitinib,商品名Iressa）、埃罗替尼（Erlotinib,商品名Tarceva）

◆检测HER2状态的临床价值胃癌靶向治疗患者筛选、疗效预测

1.2常用分子病理技术

◆免疫组织化学（IHC）技术－检测蛋白

◆分子原位杂交－DNA，RNA

◆荧光原位杂交（FISH）技术－DNA，RNA

◆多聚酶链式反应PCR技术－DNA，RNA

◆荧光定量PCR－DNA，RNA

◆DNA测序技术－DNA突变

◆生物芯片技术－DNA，RNA，蛋白质等

◆DNA印迹（Southernblot）

◆微卫星不稳定检测（MSI）

医院病理科开展分子病理实验项目，一般从实用出发，二级医院主要开展荧光原位杂交（FISH）项目，三级医院主要开展荧光原位杂交（FISH）、荧光定量PCR项目，有条件的三级医院可以开展DNA基因测序项目。

1.3FISH-荧光原位杂交

FISH技术是一种通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交，在荧光显微镜下能原位显示细胞核内杂交信号的分子细胞遗传学技术。

FISH技术检测基因扩增的准确性比其他检测技术高，可以避免由于染色体的多体而呈现的假阳性，被誉为“金标准”。

◆实验流程

FISH样本的制备--探针的制备--探针标记--杂交--（染色体显带）--荧光显微镜检测--结果分析

◆FISH优点

1.荧光探针商业化、采购方便、保存安全。

2.实验周期短、特异性好、定位准确。

3.可定位1KB的DNA序列，灵敏度高

4.一次染色可获取24种不同颜色的染色体，对于隐匿性的缺失、异位诊断准确。

◆FISH技术在医院的运用

一切与染色体相关的科室。

特别是病理科、血液科、妇产科、生殖中心（产前诊断、植入前诊断）等。

目前应用于临床检测的FISH基因探针有接近于一百种。

在美国，FISH探针已被FDA列为“特异性分析试剂”，不需批准即可用于临床医学检测。

所以，FISH检测在国外应用非常广泛和迅速。

如Vysis、Cytocell等公司，其产品已遍布全球，但其价格较贵，严重阻碍了在我国国内的推广。

国内厂家，如金菩嘉和广州安必平，近年来发展迅速，品种覆盖范围较广，且产品质量保证、性价比高。

并且，更为有利的是，国内公司供货快速及时、售后服务好。

由于国内厂家的崛起，近年来国内医院开展FISH检测的速度大大加快。

◆FISH技术实验室基本要求

①实验室环境：

样本准备区、暗室（10-15平米左右）；

②实验设备：

荧光显微镜以及荧光成像分析系统、水浴锅、原位杂交仪、冰箱、离心机、恒温箱

③办公设备：

电脑、打印机

④实验耗材：

FISH探针，进口如雅培、罗氏

细胞类探针：

诸如血液病类，如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等。

其次，产前诊断和产后筛查类；

实体肿瘤类探针：

病理科在检测乳腺癌、子宫颈癌、膀胱癌、肺癌、宫颈癌、软组织肉瘤、前列腺癌、甲状腺癌等方面。

⑤技术人员：

1人

1.4部分FISH产品对比（厂家提供，仅供参考）

品牌

比较

广州安必平

金菩嘉

雅培（Vysis）

探针种类

覆盖70种肿瘤探针，品种齐全，覆盖了实体瘤及血液疾病。

约40种，部分肿瘤没有覆盖。

探针质量

用多个克隆标记探针，信号灵敏，背景低，质量与国外相当。

实体瘤探针质量与国外相当，但血液病探针信号不佳。

探针信号灵敏，背景低，质量好。

价格

由于有自己的研发团队，探针都为自产，成本较低，具有强大的价格竞争力，本公司的出现也打破了国内公司一家独大的垄断。

价格比雅培低，但高于安必平。

由于异国操作，运营成本高，价格高。

操作便利性

即用型探针：

探针溶液已包含杂交液组分，可直接点样杂交，无需杂交前溶解探针和混匀探针及杂交液，方便操作和减少出错。

探针与杂交液分开，杂交前需在黑暗环境中混合两者，操作不变、容易出错。

辅助试剂

配送FISH所需的常规试剂（蛋白酶K或胃蛋白酶、NP-40、多聚甲醛、20×

SSC等），节约客户采购时间及成本。

搭配蛋白酶K一起销售。

搭配蛋白酶K、NP-40等一起销售。

荧光显微系统配置

从客户出发，帮客户选用性价比高的荧光显微镜及图像分析软件，操作便利，性价比高。

满足要求，但价格较高。

满足要求，但价格较高，且客户可能需自己配置系统。

显微镜

明场观察

配相差功能，可镜下仔细观察蛋白酶消化状态，对小体积样本及珍贵样本处理特别有效，避免消化不佳导致杂交结果不好。

不配相差功能。

标配滤块

对新客户标配四种颜色的荧光滤块（DAPI、绿、红、青），可同时满足实体瘤及产前诊断。

只标配三种颜色滤块（DAPI、绿、红），如需开展产前诊断的话客户还要额外购买青色滤块。

只标配三种颜色滤块（DAPI、绿、红）；

如需开展产前诊断的话客户还要额外购买青色滤块，且需用到金色滤块（容易出现窜色），滤块配置要求太高。

检测靶标

因为标配了四种滤块，可同时检测三个靶标（绿红青），临床检测效率高、能降低试剂成本、且能应用于多靶标检测的科研课题。

只有两个靶标的试剂（绿红），靶向选择及组合受限。

有同时检测三个靶标的试剂，但因为不是标配，应用受限。

图像分析软件

有自主研发的图像分析软件，降低客户采购成本。

外购。

品种设计

因为所有探针都为自主研发，可为客户灵活设计产品探针组成，以便临床、科研充分使用及降低试剂成本

探针不能根据客户需求进行调整，可能存在试剂成本较高的风险。

特色产品

能设计多个“二合一”探针组合；

15种微缺失探针（用于流产原因筛查及其他少见综合症）；

只有部分基因探针。

不能根据客户需求设计“二合一”探针。

国内SFDA证书

两个产品取得注册受理号，即将取得注册证书。

几个产品取得注册证书。

两个产品取得注册证书。

地理位置

位于广州，华南地区客户地理位置近，送货及服务及时到位。

位于北京，华南地区服务不便。

位于国外，国内虽有代理，但售后服务及技术支持不能最快反应。

平台支持

有多年其他产品的网络支持，如病理科中的液基细胞学平台，与客户建立了多年来的良好关系。

产品单一，只有FISH试剂，设备、人员投入高。

有其他试剂，但病理科中只有FISH，无其他平台支持。

售后服务

借助于广泛的液基细胞学网络及合作公司达安基因的全国网络，售后服务迅速周到。

售后服务网络单一，售后服务风险较高。

优势资源

与达安基因合资，充分利用全国广泛的销售及技术支持资源。

——

特殊资源

有自己的学术核心期刊《分子诊断与治疗》，方便客户课题研究。

无

1.5实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

◆临床疾病诊断：

各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价；

地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测；

肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；

遗传基因检测实现遗传病诊断。

◆实时荧光定量PCR分子病理诊断应用

•绝对定量（AbsoluteQuantification）

>

病原体检测（HiV,HBV,结核杆菌,H1N1等）

基因表达研究（白血病融合基因表达检测）

•相对定量（RelativeQuantification）

肿瘤组织中的特定基因表达（EGFR,VEGFR,BRCA1&

2,ERCC1&

2,RRM1）

肿瘤Bio-Marker特定miRNA检测——1900多个试剂盒

CNV研究