生物技术制药重点11Word下载.docx

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4.限制性核酸切酶：

主要指来自于细菌、能够识别DNA特定序列、并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类切酶。

具有专一性。

5.DNA连接酶：

可以催化DNA片段中两个相邻的3-OH和5'

-磷酸基团（互相配对的两个粘性末端连接起来）形成3'

，5'

-磷酸二酯键，从而使DNA片段或单链断裂形成的缺口连接起来。

6.获得目的基因的主要方法：

①化学合成法：

已知目的基因的核苷酸序列或其编码产物的氨基酸残基序列。

＜100个碱基。

小片段粘接法：

12-15个碱基，退火形成双链；

大片段酶促法：

100个碱基以下，利用聚合酶和连接酶形成。

②PCR：

（已知目的基因的序列）根据生物体DNA复制原理在DNA聚合酶催化和dNTP参与下，引物依赖DNA模板特异性地扩增DNA。

PCR体外扩增常容易带入突变，为保证目的基因片段序列的正确性，一般建议使用高保真的DNA聚合酶和相对保守的PCR扩增条件。

同时PCR得到的片段在克隆后必须进行测序分析。

③cDNA文库法：

表示表达信息的微生物。

代表了细胞或组织所表达的全部蛋白质，从中获取的基因序列也都是直接编码蛋白质的序列

④基因组DNA文库法：

表示遗传信息的微生物。

是指某一特定生物体全部基因组DNA序列的随机克隆群体的集合，以DNA片段的形式贮存了所有的基因组DNA信息，包括所有外显子和含子。

7．质粒的结构和特点：

（1）细胞拟核之外的小的环状DNA分子

（2）存在于细菌、霉菌、酵母菌等细胞里，对细胞的正常生活几乎没有影响

（3）能够在宿主细胞中自主复制

（4）可以容易地从细胞中取出或放入

2.载体的要素、分类P13

（1）质粒载体的三个要素:

复制子（复制起始点），选择标记（用于鉴定和筛选转化有质粒的宿主细胞），多克隆位点（质粒载体中由多个限制性核酸切酶识别序列密集排列形成的序列，用于将目的基因插入多克隆位点中相应的酶切部位）。

分为克隆载体（用于外源DNA的扩增），表达载体（用于外源目的基因的有效转录和翻译），突变载体（通过对载体抗性的选择来实现筛选突变克隆的目的），报告载体（以易于检测的基因作为报告基因，通过报告基因的表达强度来研究外源调控因子的功能）。

（2）载体分质粒载体和λ噬菌体载体（常用于构建基因组文库和cDNA文库）。

入噬菌体载体分为插入型和置换型两类。

3.重组DNA导入宿主细胞

常用方法：

①转化；

②感染；

③转染；

④显微注射；

⑤电穿孔

重组DNA导入细菌：

1化学转化法：

对数生长期细菌②

2感染法：

以病毒形式

3穿孔法：

高压脉冲

重组DNA导入酵母：

①电转化法（方便、快速、高效）；

②化学转化法（简单、设备要求低）；

③原生质体转化法

重组DNA导入哺乳动物细胞：

显微注射法和电转化法；

转染法；

病毒感染法。

4.重组子的筛选与鉴定

1）载体遗传标记法：

抗生素抗性筛选法；

α-互补筛选法；

营养缺陷型筛选法；

噬菌斑筛选法

2）核酸分子杂交法

3）限制性切酶图谱法

4）DNA序列测定法

5）目的基因表达产物测定法

3.基因重组蛋白的主要纯化技术P26-28

（1）离子交换层析:

利用蛋白质等电点的差异，通过带电的溶质分子与离子交换剂中可以交换的离子进行交换。

a.离子交换剂：

阴离子交换剂、阳离子交换剂、两性离子交换剂、选择性离子交换剂。

b.影响因素：

盐离子浓度、离子大小、洗脱梯度与流速。

（2）亲和层析：

利用固定化配基于目的蛋白之间特异的生物亲和力进行吸附。

a.亲和作用包括酶与激活剂/受体/底物之间、抗体与抗原之间、受体与激素/配体之间、蛋白质与DNA/RNA结合域之间。

b.亲和层析步骤：

配基固定化；

亲和吸附；

洗涤；

洗脱解离；

再生。

c.合适的配基：

特异性、亲和力适中

（3）凝胶过滤层析：

根据生物大分子的Mr的大小来实现目的蛋白的分离纯化。

a.主要用于脱盐、分级分离及Mr的测定：

脱盐是将无机盐与生物大分子分离；

分级分离将不同Mr大小的分子分开；

标准样品作对照时，用凝胶过滤可以测定生物大分子的Mr。

b.优点：

分离蛋白质的Mr围广、不带电荷的惰性基质不与溶质分子发生任何作用、凝胶介质可以反复使用。

（4）反相层析和疏水层析：

根据蛋白质疏水性的差异来实现分离纯化。

a.反相层析：

利用溶质分子中非极性基因和非极性固定相之间相互作用力的大小，以及溶质分子中极性基因与流动相中极性分子之间在相反方向作用力的大小的差异进行分离。

b.疏水层析：

利用蛋白质分子表面的疏水区域和介质的疏水基因之间的相互作用。

c.反相层析：

有机溶液洗脱，蛋白质可能变性，疏水层析：

盐溶液洗脱

第三章动物细胞工程制药

1.体外培养动物细胞的类型：

①贴壁依赖性细胞：

培养时需要贴附因子。

大多数动物细胞，包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细胞；

②非贴壁依赖性细胞：

无需固体支持物，在培养液中悬浮生长。

一般来源于血液、淋巴组织的细胞和杂交瘤细胞；

③兼性贴壁细胞

2.动物细胞培养的环境条件：

①培养温度：

哺乳类37；

昆虫细胞25-28

②pH：

大多数动物细胞适合在pH7.2-7.4生长。

低于6.8或者高于7.6时，对细胞生长不利。

加适量磷酸盐缓冲液维持相对稳定的pH。

加空气、氧气、二氧化碳和氮气的混合气体进行供氧和调节。

酸碱指示剂

3通氧量：

CO2比例

4防止污染

5基本营养物质：

除三大营养物质外，还需一定量的维生素、激素类物质和促细胞生长因子。

6透压：

理想围：

260-320mOsm/L

3.动物细胞工程制药：

利用动物细胞（包括原代细胞、二倍体细胞、异倍体细胞、融合或重组的细胞）为宿主或者反应器，也包括利用转基因动物作为反应器，进行疫苗、多肽和蛋白质等生物制品的生产。

4.细胞传代，细胞冻存及复苏（重点掌握关键步骤及原则）P50-51

（1）细胞的传代培养:

将细胞从一个培养器皿中消化、分散并接种至另一个培养器皿中的操作称为细胞传代。

为了维持细胞的生长和获得更多的细胞量往往要进行细胞的传代培养（subculture）。

否则会因密度过大、生存空间不足、代谢产物在培养液里的浓度过高等因素造成细胞衰老。

在传代过程中要注意减少对细胞的损伤以及培养基和培养条件的相对稳定。

（2）动物细胞的冻存与复苏

细胞的冻存

在-70℃以下时，细胞的酶活性均已停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。

目前保存细胞，都采用液氮低温（-196℃）冻存的方法。

细胞低温保存的关键在于通过0～-20℃阶段的处理过程。

冷冻速度太慢细胞、外环境的水会形成冰晶，易损伤细胞，太快不足以使水分排出。

注意事项：

a.冻存的细胞应在对数生长期且存活率高的状态;

b.冻存的细胞营养状态良好;

c.细胞密度以1×

106~2×

106细胞/mL为好;

d.配制冻存用培养基要与实际使用的一致，加保护剂10%（v/v）二甲基亚砜或甘油;

e.细胞冻存管口密封性要良好;

f.做好相关标注。

②细胞复苏的原则是快速融化

必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

a.注意防护，以防渗入液氮引起安瓿爆炸；

b.从液氮取出应立即37℃水浴，并不断摇动使液体迅速融化；

c.液体溶解后取出，用乙醇擦拭外壁；

d.尽早离心，以去除二甲基亚砜；

或先直接种入培养瓶，加培养液，待细胞贴壁后立即换液；

e.隔天观察生长情况，再换液一次。

第四章抗体工程制药

5.抗体的结构，各部分功能及对应缩写P79

（1）基本结构：

抗体单体由4条多肽链（2条相同的重链H和2条相同的轻链L）通过二硫键（-S-S-）而成，为“Y”字形结构。

（2）轻链重链可变区与恒定区超变区与骨架区铰链区（图片）

（3）恒定区C区的功能

a.激活补体系统

抗体（IgM、IgG）与抗原结合形成复合物可通过启动C1q激活补体经典途径；

IgG4、IgA和IgE的聚合物可以激活补体旁路途径。

b.介导免疫细胞活性

抗体的调理作用；

ADCC作用；

介导超敏反应。

c.穿过胎盘与黏膜

IgG是唯一能够从母体通过胎盘屏障转运到胎儿体的抗体（胎儿抗感染）。

分泌型IgA合成和主要作用部位在黏膜（黏膜局部抗感染）

（4）可变区V区的功能识别并特异性结合抗原：

a.与毒素结合可以中和其毒性b.与病原体结合，可以组织其对机体细胞的黏附和感染

水解片段（图片）

6..基因工程抗体P92

抗体及抗体片段

（1）人—鼠嵌合抗体（chimericantibody）鼠IgV-人IgC

人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。

（2）改形抗体（Reshapedantibody）也称CDR移植抗体、人源化抗体。

Ig分子中参与构成抗原结合部位的区域是H和L链V区中的互补性决定区（CDR区）

（3）小分子抗体

小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最小识别单位等几种

Fab和Fv抗体

（1）Fab抗体：

完整的轻链+重链（VH和CH1）

（2）FV抗体：

VH+VL，天然FV片段中VH和VL为非共价性结合,不稳定。

（在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一条单链，得到ScFv，即单链抗体）

单链抗体VH-linker-VL

单域抗体和分子识别单位

（1）单域抗体:

由VH（VL）单个可变区组成的，只有抗体分子的1/12，而且表面疏水性强，与抗原非特异结合能力也强。

（2）分子识别单位（MRU）:

也称为超变区多肽，是由单个CDR区构成的小分子抗体，亲和力较低。

双链抗体（bispecificantibody,bsAb）

有两个不同的抗原结合部位，可分别结合两种不同的抗原表位。

其中一个可与靶细胞表面抗原结合，另一个则可与效应物结合，将效应物直接导向靶细胞。

抗体偶联物

放射性同位素标记的抗体治疗药物、抗癌药物偶联的抗体药物、毒素偶联的抗体药物

抗体融合蛋白

Fv抗体融合蛋白：

与毒素、酶、细胞因子等融合，导向治疗

Fc抗体融合蛋白：

与抗体、蛋白融合，检测、纯化、介导抗体效应功能、提高蛋白半衰期

第五章疫苗及其制备技术

1.疫苗：

将病原微生物（细菌、病毒、真菌、立克次氏体、支原体、衣原体等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的免疫制剂，例如流感疫苗、乙肝疫苗、霍乱疫苗等。

2.疫苗的组成：

具有免疫保护性的抗原（免疫原性，产生免疫效应物质；

免疫反应性，产生免疫反应），如蛋白质、