化学发光文档格式.docx

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2）偶合反应CL分析法（通过反应的偶合，测定体系中某一组份；

3）时间分辨CL分析法（即利用多组份对同一化学发光反应影响的时间差实现多组份测定）；

4）固相、气相、掖相CL。

分析法；

5）酵联免疫CL分析法等。

化学发光的系统一般可以表示为：

在整个的检测系统中其关键的部分为PMT，其直接影响到仪器的检测性能，其最高检测极限为10－22mol/L。

不同型号的仪器其检测技术不一样，但基本原理都是利用待测组份与体系的化学发光强度呈线性定量关系，而化学发光强度随体系反应进行的速度增强或衰弱。

记录仪记录峰形，以峰高定量，也可以峰面积定量。

因化学发光多为闪烁式发光（1—2s左右），故进样与记录时差短，分析速度快。

第二部分、化学发光常用的化学试剂及其原理

化学发光是某种物质分子吸收化学能而产生的光辐射。

任何一个化学发光反应都包括两个关键步骤，即化学激发和发光。

因此，一个化学反应要成为发光反应，必须满足两个条件：

第一：

反应必须提供足够的能量（170～300KJ／mol），第二，这些化学能必须能被某种物质分子吸收而产生电子激发态，并且有足够的荧光量子产率。

到目前为止，所研究的化学发光反应大多为氧化还原反应，且多为液相化学发光反应。

化学发光反应的发光效率是指发光剂在反应中的发光分于数与参加反应的分子数之比。

对于一般化学发光反应，值约为10－6，较典型的发光剂，如鲁米诺，发光效率可达0.01，发光效率大于0。

01的发光反应极少见。

现将几种发光效率较高的常用的发光剂及其发光机理归纳如下。

1.鲁米诺及其衍生物

鲁米诺的衍生物主要有异鲁米诺、4—氨基已基—N一乙基异鲁诺及AHEI和ABEI等。

鲁米诺在碱性条件下可被一些氧化剂氧化，发生化学发光反应，辐射出最大发射波长为425nm的化学发光。

在通常情况下鲁米诺与过氧化氢的化学发光反应相当缓慢，但当有某些催化剂存在时反应非常迅速。

最常用催化剂是金属离子，在很大浓度范围内，金属离子浓度与发光强度成正比，从而可进行某些金属离子的化学发光分析，利用这一反应可以分析那些含有金属离子的有机化合物，达到很高的灵敏度。

其次是利用有机化合物对鲁米诺化学发光反应的抑制作用，测定对化学发光反应具有猝灭作用的有机化合物。

其三是通过偶合反应间接测定无机或有机化合物。

其四是将鲁米诺的衍生物如异鲁米诺（ABEI）标记到羧酸和氨类化合物上，经过高效液相色谱（HPLC）或液相色谱（LC）分离后，再在碱性条件下与过氧化氢－铁氰化钾反应进行化学发光检测。

也可以采用其它分离方法，如将新合成的化学发光试剂异硫氰酸异鲁米诺标记到酵母RNA后，通过离心和透析分离，然后进行化学发光检测。

此外应用的还有N2（B2羧基丙酰基）异鲁米诺，并对其性能进行了研究。

2．光泽精

光泽精以硝酸盐的形式存在，在碱性介质中，过氧化氢将其氧化成四元环过氧化物中间体，而后裂解生成激发态的吡啶酮而发光。

利用光泽精与还原剂作用，可用于测定临床医学上一些重要的还原性物质，如抗坏血酸、肌酸酐、谷胱甘肽、葡萄糖醛酸、乳糖、葡萄糖。

3．洛粉碱

洛粉是文献上记载最早的化学发光试剂，但却迟迟未得到应用，直到1979年Marino等人将它应用于Co的测定后才得到重视。

此试剂已被用于多种元素的分析测定。

4．过氧化草酸酯类

草酸盐类化学发光反应大都生成过氧草酰（Peroxalate）中间体，因此这类反应亦称过氧草酰类化学发光反应。

过氧草酸盐类化学发光分析应用的推广还有赖于新的荧光衍生试剂的开发。

5．吖啶酯类

McCapr等合成了一系列吖啶酯类化合物，对该类试剂的化学发光机理研究表明，发光效率与试剂中的可解离酸性基团的pKa有密切关系，pKa一般应小于11。

吖啶酯类化合物是一类很有前途的非放射性核酸探针标记物，用作DNA的发光探针，发光量子产率高，稳定性好，标记物对杂交反应的动力学和杂交体的稳定性无影响，可以直接在碱性介质中进行化学发光反应。

以上五种化学发光剂化学发光量子产率高，水溶液稳定，能被多种氧化剂直接氧化而发光，也可被众多的金属高于催化发光反应而发光，许多无机、有机和生化组分也能增强或抑制其发光，因此应用十分广泛。

目前报道的有邻菲咯啉，碱基水杨酸、罗明丹—B、没食子酸、香豆素、皮素，茜素紫、苏木色精，培花青，三苯甲烷类染料，丙酮、乙醇、羟胺等。

这些试剂商品化程度高，价廉，使用方便，但化学发光量子产率较低，因此，研究增敏试剂来提高它们的化学发光量子产率是非常关键的。

第三部分　化学发光的应用

• 

无机化合物化学发光分析

1.1金属离子分析

痕量金属离子对化学发光反应具有很好的催化作用，因而化学发光测定金属离子得到广泛的应用（见表1）。

但是，由于不同金属离子催化氧化发光试剂时，发光光谱相同，致使金属离子催化化学发光反应的选择性较差。

为提高分析的选择性，可采用以下方法:

（1）利用待测金属离子与干扰离子配合物稳定性不同进行选择性分析，如加入掩蔽剂EDTA或水杨酸掩蔽干扰离子;

（2）优化实验条件以减少其它离子的干扰;

（3）稀释样品溶液;

（4）加入敏化剂。

但是，当样品中待测物相对于干扰物浓度很小时，上述方法也无济于事，只得进行前处理，常用的分离方法有色谱、溶剂萃取等。

色谱分离的高选择性与化学发光检测的高灵敏度相结合，是一种很有前途的联用技术。

关键是流动相的选择，流动相选择得好，不仅可以提高选择性，还可以进行多个离子的同时测定。

如用离子交换分离法同时测定Cr（à

）和Cr（?

）。

溶剂萃取也是提高化学发光测定金属离子选择性的一个有效方法。

这种方法的主要问题是费时，因为进行化学发光检测前必须将无机物从有机溶剂中反萃取出来，或是将有机溶剂蒸发除去。

较好的方法是自动在线溶剂萃取选择性检测待测物。

1.2其它无机化合物的分析　

化学发光反应中，过氧化氢是最常用的一种氧化剂，因此有关H2O2化学发光分析的报道较多（见表2），涉及到鲁米诺、过氧草酸酯及光泽精等化学发光反应。

根据鲁米诺化学发光反应制成的H2O2光纤传感器与流动注射法联用，可检测10nmol／L～1mmo／L的H2O2，用模拟酶代替辣根过氧化物酶催化鲁米诺发光，检测限可达5.5×

10－9mol／L。

根据ClO-对鲁米诺的氧化作用，可用于测定ClO-，其它物质如Cl2的干扰，可用流动注射法消除。

利用停流技术测定水中ClO-不必进行前处理。

含氮的无机化合物如NH3／NH+4，可将其衍生后用TCPO化学发光法检测，线性范围为2。

9ug／L～6mg／L。

CN－能抑制鲁米诺H2O2－Cu（II）的化学发光，据此可分析测定CN—。

在低温条件下化学发光分析测定CN－，当进样量为100uL时，线性范围为10－9－10-7g／mL，当进样量20uL时，线性范围为10－8～5×

10-7g／mL。

有机化合物的化学发光分析

2.1有机酸

有机化合物的同系物结构和性质相似，使单一组分的测定遇到困难，因此有机化合物同系物的分析常与HPLC相结合。

有机酸的化学发光分析（见表3），一般是先将其衍生成荧光物质经色谱分离后进行化学发光检测。

但衍生法有如下的缺点:

（1）衍生反应不完全;

（2）衍生物稳定性差，要求及时检测;

（3）限制了分离方法和条件的选择。

由于衍生产物的性质与待测物不同，导致分离效率和分辨率下降，同时增加分析的时间和劳动强度。

在临床医学上，草酸是一个重要的检测项目，可以直接用氧化化学发光反应测定尿液和草酸二乙酯中的草酸盐及游离的草酸。

另外还可以测定苯酮尿症病人的尿液的苯丙酮酸的含量，方法是先在碱性条件下将苯丙酮酸氧化成1，22二氧杂环丁烷类化合物，然后裂解产生化学发光。

另外可以将Fe（III）草酸配合物光解得到Fe（II），催化鲁米诺－过氧化氢化学发光反应，此法线性范围为0.1～100uM。

此外酶联偶合反应也可以用于某些有机酸的化学发光分析。

2.2有机碱　

胺类化合物第一离子化电势呈如下规律:

伯胺>

仲胺>

叔胺，并随碳链增长，离子化电势逐渐下降，因此叔胺化合物的检测限较低，达0.28pM。

胺类化合物的分析（见表4），较多的是经柱前衍生生成荧光衍生物，分离后用过氧草酸盐化学发光体系检测，也可将其生成希夫碱或其它产物氧化而发光。

有些碱如肾上腺素等可直接氧化而发光。

通常有一个经验规则，假如一物质具有荧光或其反应产物有荧光，该物质一般可发生化学发光反应，但也有例外。

嘌呤碱是核酸的基础物质，因此对嘌呤碱的分析测定将推动DNA分析方法的发展。

在酸性醇液中腺嘌呤与苯甲醛反应，然后用过氧化氢氧化反应产生化学发光，此法具有很好的选择性，线性范围为1.5×

10－7～5.0×

10－7M，用此法测定鸟嘌呤灵敏度比荧光法高20倍。

2.3　氨基酸　

氨基酸分析方法的改进有利于推动生物技术、基因工程、DNA重组和基因克隆等的发展。

由于绝大多数氨基酸没有内源荧光特性，因此用过氧草酸盐体系测定氨基酸需将其衍生成荧光物质，但此法避免不了衍生法所固有的缺点。

此外亦可通过测定氨基酸与氨基酸氧化酶反应产生的过氧化氢来测定氨基酸的含量，如L2氨基酸经反相色谱柱分离后流经L2氨基酸氧化酶反应器产生过氧化氢，然后用过氧草酸盐体系检测。

氨基酸与Ru（bipy）3+3反应，用流动注射化学发光法检测，相对于脯氨酸和天冬酰胺检测限可分别达到20pmol和50pmol。

一般来说，仲胺反应产生的的发光强度比伯胺大。

对氨基酸上取代基性质研究表明，给电子基有利于增强化学发光强度。

2.4糖类　

光泽精体系可用于测定一些还原性物质，如乳糖、葡萄糖，用于抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的分析测定有很高的灵敏度。

但此法用于复杂样品分析却因干扰多而受到限制。

用草酰胺化学发光照相法测定了葡萄糖。

在微量滴定板上将草酰胺发光剂、荧光增感剂及50uL试样混合，于5min内用照相荧光剂测定液斑的发光强度，可检出100pmol的萄萄糖。

糖类物质测定的另一个重要方法是测定酶反应产生的H2O2，由此对酶底物——葡萄糖、乳糖等进行测定。

而酶的固定化技术为此法的发展注入了新的活力。

采用物理包埋法将葡萄糖氧化酶固定在聚丙烯酰胺凝胶中并制成酶柱，再将酶柱接入流动注射系统中，