肾活检组织标本的制作Word下载.docx

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如果穿刺仅获一条组织，所取组织有三种情况（图3-10-1）：

整条均为皮质，皮髓组织和皮-髓-皮质组织，髓质区血供丰富，颜色略红，皮质区组织略白，分布的红色小点是肾小球，根据穿刺获取不同组织的情况，如图3-10-1所示进行分取。

也有人建议纵切后，一半送光镜检查，一半分割后分送免疫荧光和电镜检查，但存在组织太细，不易观察的缺点，临床较少使用。

⑤分送免疫荧光检查的组织用无菌的TRIS或PBS溶液浸湿的沙布轻轻包裹，置于培养皿中，避免直接置于冰块上，以免局部组织因冷冻收缩，造成结构破坏[1,2]。

肾活检穿刺组织的分取

图3-10-1肾活检穿刺组织的分取

LM：

光镜；

IF：

免疫荧光；

EM：

电镜

二、光镜标本的处理

（一）固定

光镜标本的固定液有多种。

目前最常用的固定液为10%的中性福尔马林。

中性福尔马林固定液的配方：

甲醛（40%）100ml、蒸馏水900ml、磷酸二氢钠4g、磷酸氢二钠6.5g，固定时间至少6~12h。

（二）前期处理

1.脱水脱水的目的是去除固定和水洗后组织中的水分，便于后续的透明和浸蜡，常用的脱水剂是乙醇或丙酮，后者脱水能力比乙醇强，但对组织收缩较大，致使组织变脆，多用于快速脱水。

为了彻底脱水，一般常规采用不同浓度梯度的乙醇进行脱水：

①70%乙醇10~20min，2次；

②80%乙醇10~20min，2次；

③90%乙醇10~20min，2次；

④95%乙醇10~20min，2次；

⑤无水乙醇10~20min，2次。

2.透明透明的目的是便于石蜡包埋，因为组织脱水后，所用的脱水剂大多数不能和石蜡相混合，必须通过透明剂的作用才能浸蜡，所用的透明剂必须既能和脱水剂相混合，又能和石蜡相混合，起到桥梁作用，不但能提出脱水剂，又能代替脱水剂利于石蜡的浸入。

当组织全部为透明剂占有时，光线可以透过，组织可呈现不同程度的透明状态，故称为透明。

透明剂都是石蜡溶剂，绝大多数都不能及水混合，最常用的透明剂包括二甲苯、苯、甲苯、氯仿、香柏油、丁香油等。

（1）二甲苯：

是应用最广的一种透明剂，价格便宜，沸点为144C，折光率为1.497，易挥发，无色透明液体，易溶于乙醇又能溶解于石蜡，不能和水混合，透明力强，作用较快。

最大的缺点是容易使组织收缩变硬变脆，所以组织不能停留过久。

通常在组织进入二甲苯以前先经过1/2纯乙醇和1/2的二甲苯的混合液。

（2）甲苯：

性质同二甲苯，沸点110.8C，价格亦较便宜，透明较慢，但优点是组织在其内停留12~24h也不变脆，故优于二甲苯。

（3）氯仿：

组织在其中浸存较久时收缩不明显，也不变脆。

因为它的易挥发性，渗入组织的氯仿，高温时比二甲苯易挥发，是其优点。

缺点是渗透力稍弱，比二甲苯和甲苯慢，故透明时间较二甲苯时间延长2-3倍。

3.浸透和包埋组织经过脱水和透明后，要让石蜡等支持剂透入内部使组织变硬，并将组织包埋以利于切片，这个过程称为“浸透”和“包埋”。

浸透的目的在于去除组织中的透明剂而代之以石蜡，使石蜡渗入组织内部后把软组织变为有硬度的蜡块，便于切片。

石蜡是最常用的包埋剂。

使用优质石蜡能保证切片厚度，无刀痕。

根据石蜡熔点不同，石蜡分为软蜡和硬蜡，软蜡熔点低，硬蜡熔点高。

一般在室温高时用熔点高的蜡，室温较低时用熔点低的蜡。

4.切片将蜡块修理成小梯形状，进行连续切片，常规切片厚度为2m，有条件可进行1.5m的连续切片。

对于特殊染色，如刚果红则需厚度为5m的切片[3~5]。

（三）染色

肾组织标本既要观察细胞结构，又要观察基底膜病变，许多肾脏疾病及免疫复合物相关，因此肾活检标本除常规苏木素-伊红（Hematoxyln-Eosin，HE）染色，需要多种特殊染色如PAS（periodic-acidschiff，PAS）、PASM（periodicacid-silvermethenamine，PASM）和Masson三色染色等[6~8]。

1.苏木素-伊红染色法HE染色法即常规染色法，主要显示各种组织正常成分和病变的一般形态结构，进行全面观察。

目前关于病理组织学的基本知识，绝大部分都是基于对HE染色切片的观察。

在HE染色上基本可以观察到各种组织或细胞的一般形态、结构特点和病变的发生、发展及修复。

（1）苏木素染液配制方法：

将苏木素溶于乙醇，倾入明矾液中，混合后煮沸，加入氧化汞1g，以玻棒搅匀，溶液呈深紫色，立即移入冷水中，使之冷却。

静置过夜，过滤封闭保存，用前若加5％醋酸则染色较佳。

配方为：

苏木素0.9g、醋酸12ml、氧化汞0.5~1.0g、蒸馏水200ml、纯乙醇10ml、甘油20ml、钾明矾20g。

（2）伊红乙醇配制方法：

将伊红乙醇溶解后，用滴管滴加醋酸使其呈糊状，加数毫升蒸馏水即可，过滤，将滤出的沉渣在烤箱中烤干，溶于95％乙醇200ml中即可。

伊红1g、蒸馏水10ml、醋酸数滴。

（3）染色过程：

①切片常规脱蜡入水；

②苏木素染色3~10min；

③自来水充分冲洗3~5min；

④0.5%~1%的盐酸乙醇分化数秒钟；

⑤自来水冲洗1~5min；

⑥弱碱性水溶液返蓝；

⑦自来水至蒸馏水冲洗5~10min或更长；

⑧0.5%~1%的伊红3min；

⑨乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

（4）染色结果：

细胞核被苏木素染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，黏液呈灰蓝色。

细胞质被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞质内嗜酸性细胞颗粒被染成反光强的鲜红色，胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色。

高质量的HE染色细胞核及细胞质蓝红相映，且胞核鲜明，核膜、核仁及核染色质颗粒均清晰可见（图3-10-2）。

图3-10-2HE染色：

细胞质呈红色，细胞核呈蓝色（400）

2.PAS染色法PAS染色法属于特殊染色，不仅能显示糖原，而且还能显示中性和某些酸性黏液性物质、软骨、脑垂体、霉菌、脂质、色素、淀粉样物质及基底膜。

PAS的染色原理为：

过碘酸是一种氧化剂，它能氧化糖类及有关物质中的1,2-乙二醇基，使之变为二醛；

醛及Schiff氏试剂结合生成一种品红化合物，显现为红色。

（1）Schiff氏液配制方法：

将蒸馏水煮沸，冷至60℃，溶入碱性品红，冷却后过滤，至50℃时加盐酸，25℃时加偏重亚硫酸钠，黑暗中贮放过夜，加入活性碳，摇1min后过滤，4℃暗色瓶中备用。

碱性品红1g、偏重亚硫酸钠2g、1N盐酸20ml、活性碳2g、蒸馏水200ml。

（2）染色过程：

②1%高碘酸氧化10min，水洗；

③Schiff氏液10min，水洗；

④苏木素染核，盐酸分化，水洗；

⑤脱水，透明，封片。

（3）染色结果：

糖原、基底膜及其他PAS阳性物质均呈红色，细胞核呈蓝色（表3-10-1）。

肾小球基底膜、系膜基质、包曼囊壁、肾小管基底膜阳性，淀粉样物质弱阳性（图3-10-3）。

3.PASM染色组织中的粘多糖和蛋白质及银化合物结合后，再经过甲醛还原成为金属银，沉淀于组织内及表面，呈黑色，因此，这些物质又称为嗜银性物质（表3-10-2）。

同时再套用Masson红复染，以显示免疫复合物的沉积。

（1）六胺银液配制（用时现配，硝酸银在切片放入染缸前加入并摇匀）。

预温蒸馏水23ml、15％六次甲基四胺6ml、5％硼砂4.5ml、冰醋酸1.0ml、磷钨酸0.8g。

PAS反应阳性物质

物质种类

举例物质

染色结果

多糖

糖原

强阳性

糖蛋白

胶原纤维、网状纤维、血清白蛋白、球蛋白

基底膜

肾小球基底膜、肾小管基底膜、包曼囊壁

中等强度

淀粉样物质

弱阳性

各种色素

脂褐素

软骨

软骨

霉菌

曲菌

表3-10-1PAS反应阳性物质

图3-10-3PAS染色：

肾小球系膜区基质，肾小球毛细血管袢，包曼囊壁及肾小管基底膜呈粉红色，细胞核呈蓝色（400）

②3%的碘溶于100ml　30%的乙醇，配制成碘乙醇，5min脱汞，水洗；

③5%硫代硫酸钠5min脱碘，水洗；

④1%高碘酸氧化20min，水洗；

⑤六胺银液45min（根据光镜下染色结果确定染色时间），水洗；

⑥3%硫代硫酸钠5min，水洗；

⑦Masson红复染；

⑧快速脱水，透明，封片。

肾小球基底膜、包曼囊壁、肾小管基底膜呈黑色，免疫复合物为红色（图3-10-4），本染色对观察肾小球基底膜病变，免疫复合物的沉积非常重要，是肾活检必不可少的染色。

图3-10-4PASM染色：

肾小球基底膜及包囊壁呈黑色，免疫复合物呈红色，可见内皮下（↑所示）、上皮侧（↑所示）和系膜区（*所示）嗜复红物沉积（1000）

4.Masson三色染色用多种（3种以上）颜色显示多种组织（结缔组织）成分，用于判定各种组织、器官的病变及修复情况，以不同色调显示及区分某些非结缔组织及物质成分。

（1）Masson红染液配制方法：

变色酸2R0.6g、蒸馏水100ml、亮绿0.3g、冰醋酸1.0ml、磷钨酸0.8g。

②苏木素染核5min，盐酸分化，水洗；

③Masson红30秒，水洗；

④0.5%亮绿30秒；

⑤快速脱水，透明，封片。

胶原纤维呈绿色，免疫复合物呈红色，纤维素呈红色（图3-10-5，表3-10-3）。

g

图3-10-5Masson三色染色：

肾小球基底膜，包囊壁呈蓝色，免疫复合物呈红色，可见内皮下（↑所示）、上皮侧（↑所示）和系膜区（*所示）（400）

5.刚果红染色刚果红是一种分子为长线状的偶氮染色剂，以胺基和淀粉样物质的羟基结合，平行的附着在淀粉样纤维上，从而使淀粉样物质被染成橙红色。

（1）刚果红染液配制方法：

1％NaOH0.3ml、80％乙醇氯化钠刚果红饱和溶液30ml。

PASM染色反应阳性物质

各种基底膜：

肾小球基底膜、包曼囊壁和肾小管基底膜

强阳性：

黑色

系膜基质

免疫复合物

红色

不嗜银

表3-10-2PASM染色反应阳性物质

Masson三色染色反应阳性物质

蓝绿色

蓝