肾活检组织标本的制作Word下载.docx

1、如果穿刺仅获一条组织，所取组织有三种情况（图3-10-1）：整条均为皮质，皮髓组织和皮-髓-皮质组织，髓质区血供丰富，颜色略红，皮质区组织略白，分布的红色小点是肾小球，根据穿刺获取不同组织的情况，如图3-10-1所示进行分取。也有人建议纵切后，一半送光镜检查，一半分割后分送免疫荧光和电镜检查，但存在组织太细，不易观察的缺点，临床较少使用。分送免疫荧光检查的组织用无菌的TRIS或PBS溶液浸湿的沙布轻轻包裹，置于培养皿中，避免直接置于冰块上，以免局部组织因冷冻收缩，造成结构破坏1,2。肾活检穿刺组织的分取图3-10-1 肾活检穿刺组织的分取LM：光镜；IF：免疫荧光；EM：电镜二、光镜标本的处理

2、 （一）固定光镜标本的固定液有多种。目前最常用的固定液为10%的中性福尔马林。中性福尔马林固定液的配方：甲醛（40%） 100 ml、蒸馏水 900 ml、磷酸二氢钠4 g、磷酸氢二钠 6.5 g，固定时间至少612 h。（二）前期处理1. 脱水 脱水的目的是去除固定和水洗后组织中的水分，便于后续的透明和浸蜡，常用的脱水剂是乙醇或丙酮，后者脱水能力比乙醇强，但对组织收缩较大，致使组织变脆，多用于快速脱水。为了彻底脱水，一般常规采用不同浓度梯度的乙醇进行脱水：70%乙醇 1020 min， 2次；80%乙醇 1020 min， 2次；90%乙醇 1020 min， 2次；95%乙醇 1020 m

3、in， 2次；无水乙醇 1020 min， 2次。2. 透明 透明的目的是便于石蜡包埋，因为组织脱水后，所用的脱水剂大多数不能和石蜡相混合，必须通过透明剂的作用才能浸蜡，所用的透明剂必须既能和脱水剂相混合，又能和石蜡相混合，起到桥梁作用，不但能提出脱水剂，又能代替脱水剂利于石蜡的浸入。当组织全部为透明剂占有时，光线可以透过，组织可呈现不同程度的透明状态，故称为透明。透明剂都是石蜡溶剂，绝大多数都不能及水混合，最常用的透明剂包括二甲苯、苯、甲苯、氯仿、香柏油、丁香油等。（1）二甲苯：是应用最广的一种透明剂，价格便宜，沸点为144 C，折光率为1.497，易挥发，无色透明液体，易溶于乙醇又能溶解于

4、石蜡，不能和水混合，透明力强，作用较快。最大的缺点是容易使组织收缩变硬变脆，所以组织不能停留过久。通常在组织进入二甲苯以前先经过1/2纯乙醇和1/2的二甲苯的混合液。（2）甲苯：性质同二甲苯，沸点110.8 C，价格亦较便宜，透明较慢，但优点是组织在其内停留1224 h也不变脆，故优于二甲苯。（3）氯仿：组织在其中浸存较久时收缩不明显，也不变脆。因为它的易挥发性，渗入组织的氯仿，高温时比二甲苯易挥发，是其优点。缺点是渗透力稍弱，比二甲苯和甲苯慢，故透明时间较二甲苯时间延长2-3倍。3. 浸透和包埋 组织经过脱水和透明后，要让石蜡等支持剂透入内部使组织变硬，并将组织包埋以利于切片，这个过程称为“

5、浸透”和“包埋”。浸透的目的在于去除组织中的透明剂而代之以石蜡，使石蜡渗入组织内部后把软组织变为有硬度的蜡块，便于切片。石蜡是最常用的包埋剂。使用优质石蜡能保证切片厚度，无刀痕。根据石蜡熔点不同，石蜡分为软蜡和硬蜡，软蜡熔点低，硬蜡熔点高。一般在室温高时用熔点高的蜡，室温较低时用熔点低的蜡。4. 切片 将蜡块修理成小梯形状，进行连续切片，常规切片厚度为2 m，有条件可进行1.5 m的连续切片。对于特殊染色，如刚果红则需厚度为5 m的切片35。（三）染色肾组织标本既要观察细胞结构，又要观察基底膜病变，许多肾脏疾病及免疫复合物相关，因此肾活检标本除常规苏木素-伊红（Hematoxyln-Eosin

6、，HE）染色，需要多种特殊染色如PAS（periodic-acid schiff，PAS）、PASM（periodic acid-silver methenamine，PASM）和Masson三色染色等68。1. 苏木素-伊红染色法 HE染色法即常规染色法，主要显示各种组织正常成分和病变的一般形态结构，进行全面观察。目前关于病理组织学的基本知识，绝大部分都是基于对HE染色切片的观察。在HE染色上基本可以观察到各种组织或细胞的一般形态、结构特点和病变的发生、发展及修复。（1）苏木素染液配制方法：将苏木素溶于乙醇，倾入明矾液中，混合后煮沸，加入氧化汞1 g，以玻棒搅匀，溶液呈深紫色，立即移入冷水中

7、，使之冷却。静置过夜，过滤封闭保存，用前若加5醋酸则染色较佳。配方为：苏木素 0.9g、醋酸 12 ml、氧化汞 0.51.0 g、蒸馏水 200 ml、纯乙醇 10 ml、甘油 20 ml、钾明矾 20 g。（2）伊红乙醇配制方法：将伊红乙醇溶解后，用滴管滴加醋酸使其呈糊状，加数毫升蒸馏水即可，过滤，将滤出的沉渣在烤箱中烤干，溶于95乙醇200ml中即可。伊红 1 g、蒸馏水 10 ml、醋酸数滴。（3）染色过程：切片常规脱蜡入水；苏木素染色310 min；自来水充分冲洗35 min；0.5%1%的盐酸乙醇分化数秒钟；自来水冲洗15 min；弱碱性水溶液返蓝；自来水至蒸馏水冲洗510 min

8、或更长；0.5%1%的伊红3 min；乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。（4）染色结果：细胞核被苏木素染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，黏液呈灰蓝色。细胞质被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞质内嗜酸性细胞颗粒被染成反光强的鲜红色，胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色。高质量的HE染色细胞核及细胞质蓝红相映，且胞核鲜明，核膜、核仁及核染色质颗粒均清晰可见（图3-10-2）。图3-10-2 HE染色：细胞质呈红色，细胞核呈蓝色（ 400）2. PAS染色法 PAS染色法属于特殊染色，不仅能显示糖原，而且还能显示中性和某些酸性黏液性物质、软骨、脑垂体、霉菌、脂质、色素、淀粉样物质及

9、基底膜。PAS的染色原理为：过碘酸是一种氧化剂，它能氧化糖类及有关物质中的1, 2-乙二醇基，使之变为二醛；醛及Schiff氏试剂结合生成一种品红化合物，显现为红色。（1）Schiff氏液配制方法：将蒸馏水煮沸，冷至60，溶入碱性品红，冷却后过滤，至50时加盐酸，25时加偏重亚硫酸钠，黑暗中贮放过夜，加入活性碳，摇1 min后过滤，4暗色瓶中备用。碱性品红1 g、偏重亚硫酸钠2 g、1N盐酸20 ml、活性碳2 g、蒸馏水 200 ml。（2）染色过程：1%高碘酸氧化10 min，水洗；Schiff 氏液10 min，水洗；苏木素染核，盐酸分化，水洗；脱水，透明，封片。（3）染色结果：糖原、基

10、底膜及其他PAS阳性物质均呈红色，细胞核呈蓝色（表3-10-1）。肾小球基底膜、系膜基质、包曼囊壁、肾小管基底膜阳性，淀粉样物质弱阳性（图3-10-3）。3. PASM染色 组织中的粘多糖和蛋白质及银化合物结合后，再经过甲醛还原成为金属银，沉淀于组织内及表面，呈黑色，因此，这些物质又称为嗜银性物质（表3-10-2）。同时再套用Masson红复染，以显示免疫复合物的沉积。（1）六胺银液配制（用时现配，硝酸银在切片放入染缸前加入并摇匀）。预温蒸馏水 23ml、15六次甲基四胺 6ml、5硼砂 4.5 ml、冰醋酸 1.0 ml、磷钨酸 0.8g。PAS反应阳性物质物质种类举例物质染色结果多糖糖原强

11、阳性糖蛋白胶原纤维、网状纤维、血清白蛋白、球蛋白基底膜肾小球基底膜、肾小管基底膜、包曼囊壁中等强度淀粉样物质弱阳性各种色素脂褐素软骨 软骨霉菌曲菌表3-10-1 PAS反应阳性物质图3-10-3 PAS染色：肾小球系膜区基质，肾小球毛细血管袢，包曼囊壁及肾小管基底膜呈粉红色，细胞核呈蓝色（ 400）3%的碘溶于100ml30%的乙醇，配制成碘乙醇，5 min脱汞，水洗；5%硫代硫酸钠5 min脱碘，水洗；1%高碘酸氧化20 min，水洗；六胺银液45 min（根据光镜下染色结果确定染色时间），水洗；3%硫代硫酸钠5 min，水洗；Masson红复染；快速脱水，透明，封片。肾小球基底膜、包曼囊壁

12、、肾小管基底膜呈黑色，免疫复合物为红色（图3-10-4），本染色对观察肾小球基底膜病变，免疫复合物的沉积非常重要，是肾活检必不可少的染色。图3-10-4 PASM染色：肾小球基底膜及包囊壁呈黑色，免疫复合物呈红色，可见内皮下（所示）、上皮侧（所示）和系膜区（*所示）嗜复红物沉积（ 1000）4. Masson三色染色 用多种（3种以上）颜色显示多种组织（结缔组织）成分，用于判定各种组织、器官的病变及修复情况，以不同色调显示及区分某些非结缔组织及物质成分。（1）Masson红染液配制方法：变色酸2R 0.6g、蒸馏水 100 ml、亮绿0.3 g、冰醋酸 1.0 ml、磷钨酸 0.8 g。苏木素

13、染核5 min，盐酸分化，水洗；Masson红30 秒，水洗；0.5%亮绿30秒；快速脱水，透明，封片。胶原纤维呈绿色，免疫复合物呈红色，纤维素呈红色（图3-10-5，表3-10-3）。g图3-10-5 Masson三色染色：肾小球基底膜，包囊壁呈蓝色，免疫复合物呈红色，可见内皮下（所示）、上皮侧（所示）和系膜区（*所示）（ 400）5. 刚果红染色 刚果红是一种分子为长线状的偶氮染色剂，以胺基和淀粉样物质的羟基结合，平行的附着在淀粉样纤维上，从而使淀粉样物质被染成橙红色。（1）刚果红染液配制方法：1NaOH 0.3 ml、80乙醇氯化钠刚果红饱和溶液 30 ml。PASM染色反应阳性物质各种基底膜：肾小球基底膜、包曼囊壁和肾小管基底膜强阳性：黑色系膜基质免疫复合物红色不嗜银表3-10-2 PASM染色反应阳性物质Masson三色染色反应阳性物质蓝绿色蓝