发酵优化文档格式.docx
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破碎液13000rpm离心20min，收集上清，即为所需的粗酶液。
依赖于NAD的D-乳酸脱氢酶（DLDH）是通过在分光光度计上340nm检测NADH的增加来测定的（TaguchiandOhta,1991）。
测定的温度对于乳杆菌DSM20314和DSM20205是37℃，而芽孢杆菌2-6分别在37℃和50℃下进行测定。
1个酶活单位（1U）定义为每分钟内积累1μmolNADH所需要的酶量。
总蛋白浓度的测定是按照文献报道的方法，利用牛血清蛋白为标准（Bradford,1976）。
DLDH的具体测定体系（1mL）为：
100mMTris-HCl缓冲液（pH8.0），100μL；
10mMNAD，100μL；
100mMD-乳酸钠，100μL；
粗酶液，适量；
蒸馏水补齐；
乳酸钠起始反应。
活性聚丙烯酰胺凝胶电泳样品的制备方法：
将粗酶液进行浓缩，取1-10μL进行活性电泳，分离胶浓度为9％，浓缩胶3.75%。
电泳完成后，将胶切成几个部分，Marker条带考马斯亮蓝染色，其余分别浸泡在底物溶液中，大约60min，直至出现明显的紫色条带（Maetal.,2007）。
底物溶液的组成：
100mMTris-HCl缓冲液（pH8.0），0.1mM吩嗪硫酸甲酯（phenazinemethosulfate，PMS），0.1mM氯化硝基四氮唑蓝（nitrotetrazoliumbluechloride），10mMNAD，100mMD-乳酸钠或DL-乳酸钠。
染色成功的关键是要分别染色，避免交互影响，另外，2-6的LDH逆反应非常的弱，添加少量Mn2+可提高着色能力。
1.7主要仪器和试剂
发酵罐
德国贝朗（B.Braun）5L搅拌式
上海保兴30L搅拌式
电热恒温培养养箱
潍坊医疗器械厂
全温振荡培养箱
哈尔滨市东联电子技术开发有限公司HZQ-F160
立式自动电热压力蒸汽灭菌器
上海申安医疗器械厂
722光栅分光光度计
上海精密科学仪器有限公司
SBA-40C生物传感分析仪
山东省科学院生物研究所
高效液相色谱仪Agilent1100
美国安捷伦公司
液相手性柱
三菱化学MCIGELCRS10W
工业葡萄糖
山东禹城
酵母粉
生化试剂，北京奥博星生物技术责任有限公司
蛋白胨
牛肉膏
生化试剂，北京双旋微生物培养基制品厂
琼脂粉
生化试剂，国药集团化学试剂有限公司
1.8分析方法
1菌体OD值和菌体干重（DCW）的测定
发酵液稀释适当倍数，分光光度计于620nm处测定光密度得到菌体OD值。
菌体干重是由光密度通过一个校准方程（DCW=0.565×
OD）转化而来。
2发酵液中葡萄糖和L-乳酸的测定方法
发酵液稀释适当倍数后离心，采用生物传感分析仪SBA-40C测定。
糖酸转化率定义为：
L-乳酸产量（g/L）/葡萄糖的消耗量（g/L）×
100％。
体积生产效率定义为：
L-乳酸产量（g/L）/发酵时间（h）。
3L-乳酸的光学纯度测定
样品处理：
发酵液沸水浴10min，12000r/min离心20min，取上清流动相稀释一定倍数后0.22μm滤膜过滤，HPLC手性柱检测乳酸光学纯度。
具体操作条件为：
0.002mol/L硫酸铜作为流动相，流量0.5ml/min，进样量20μL，紫外检测器，检测波长254nm，柱温箱温度25℃。
L-乳酸标准品为Sigma-Aldrich公司产品，货号为L1750。
D-乳酸标准品为Sigma-Aldrich公司产品，货号为L0625。
L-乳酸光学纯度（ee）＝
2结果与讨论
2.1用PB实验筛选最佳的有机氮源
氮源对L-乳酸的发酵生产至关重要，因此有必要挑选合适的氮源。
实验的设计和结果见表2.1和表2.2。
在表2.2中，每一行代表一次实验，每一列代表一个独立的变量。
正号和负号表示高和低两个水平。
通过t检验来分析每个变量的显著性水平（表2.3）。
拟合的一次方程为：
（1）
其中，x1,x2,x3,x4,x5,x6,x7是大豆肽（X1）、酵母粉（X2）、大豆蛋白胨（X3）、棉籽蛋白（X4）、蛋白胨（X5）以及豆粕粉（X6）的编码水平；
Y是L-乳酸的产量（g/L）。
分析结果显示，大豆肽、酵母粉和棉籽蛋白对乳酸发酵生产具有显著影响（显著性水平为99%，P<
0.1）。
其它四种有机氮源对发酵也有促进作用，但不显著，按对L-乳酸发酵影响由大到小的顺序是：
酵母粉>
大豆肽>
棉籽蛋白>
大豆蛋白胨>
蛋白胨＝豆粕粉。
因此挑选酵母粉、大豆肽和棉籽蛋白进行下一步实验。
表2.1PB实验设计中的因素和水平
Table2.1ScreenforthebestnitrogensourcesusingPBdesign
因素
水平
变量
氮源
低（–1）
高（+1）
X1
大豆肽（g/L）
1
3
X2
酵母粉（g/L）
X3
大豆蛋白胨（g/L）
X4
棉籽蛋白（g/L）
X5
蛋白胨（g/L）
X6
豆粕粉（g/L）
2
4
表2.2PB实验设计和结果
Table2.2DesignandresultsofthePBdesign
实验
x1
x2
x3
x4
x5
x6
x7
Y（g/L）
-1
22.5±
0.7
35.0±
1.4
30.0±
26.5±
5
32.0±
2.8
6
34.0±
7
30.5±
8
22.0±
0.0
9
21.0±
10
24.0±
11
27.5±
12
17.5±
根据实验数据，我们还使用Fisher检验来分析变异性（ANOVA）。
F值和P值分别为26.76和0.0012。
整个模型的显著性水平为99.8%。
模型拟合的质量通过判定系数（R2）来表示，它的值为0.9698，即意味着有96.98%实验结果的可变性可由这个模型来解释。
校正的判定系数（AdjR2=0.9336）也很高，也表示了这个模型的高的显著性。
这些结果都说明了我们所得到的拟合模型是合适的。
表2.3根据筛选实验得到的系数和相应的统计学数值
Table2.3Coefficientsandtvaluescalculatedfromthescreeningexperiment
系数
标准偏差
t统计量
P值
Intercept
β0=26.8333
0.4116
65.19
<
0.0001
β1=2.1667
5.26
0.0033
β2=4.5833
11.13
0.0001
β3=0.6667
1.62
0.1663
β4=0.9167
2.23
0.0765
β5=0.3333
0.81
0.4549
Β6=0.3333
2.2PB设计方法确定对L-乳酸发酵影响最大的因素
除了氮源外，其它因素对L-乳酸生产也有着一定的影响。
本实验室的前期研究结果显示，NaNO3、NH4Cl和Mg2+对乳酸发酵有着较为明显的促进作用。
另外根据多篇文献报道，维生素中生物素、硫胺素、叶酸和烟酸是凝结芽孢杆菌生长必需的（CampbellandSniff,1959;
Cleverdonetal.,1949a,1949b）。
但是前期实验表明单加以上一种维生素对发酵的影响不明显。
因此，维生素混合液（生物素20mg/L,硫胺素500mg/L,叶酸30mg/L,烟酸500mg/L）也作为下一步PB实验的一个考查因素。
实验的设计和结果见表2.4和表2.5。
7个因素各取高低两个水平进行实验，在表5中，每一行代表一次实验，每一列代表一个独立的变量。
对所得结果进行拟合，拟合的一次方程为：
（2）
其中，x1,x2,x3,x4,x5,x6,x7是大豆肽（X1
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