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1、破碎液13000 rpm离心20 min，收集上清，即为所需的粗酶液。依赖于NAD的D-乳酸脱氢酶（DLDH）是通过在分光光度计上340 nm检测NADH的增加来测定的（Taguchi and Ohta, 1991）。测定的温度对于乳杆菌DSM 20314和DSM 20205是37，而芽孢杆菌2-6分别在37和50下进行测定。1个酶活单位（1 U）定义为每分钟内积累1 mol NADH所需要的酶量。总蛋白浓度的测定是按照文献报道的方法，利用牛血清蛋白为标准（Bradford, 1976）。DLDH的具体测定体系（1 mL）为：100 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0），100 L；1

2、0 mM NAD，100 L；100 mM D-乳酸钠，100 L；粗酶液，适量；蒸馏水补齐；乳酸钠起始反应。活性聚丙烯酰胺凝胶电泳样品的制备方法：将粗酶液进行浓缩，取1-10 L进行活性电泳，分离胶浓度为9，浓缩胶3.75%。电泳完成后，将胶切成几个部分，Marker条带考马斯亮蓝染色，其余分别浸泡在底物溶液中，大约60 min，直至出现明显的紫色条带（Ma et al., 2007）。底物溶液的组成：100 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0），0.1 mM吩嗪硫酸甲酯（phenazine methosulfate，PMS），0.1 mM氯化硝基四氮唑蓝（nitrotetrazol

3、ium blue chloride），10 mM NAD，100 mM D-乳酸钠或DL-乳酸钠。染色成功的关键是要分别染色，避免交互影响，另外，2-6的LDH逆反应非常的弱，添加少量Mn2+可提高着色能力。1.7 主要仪器和试剂发酵罐德国贝朗（B. Braun）5 L搅拌式上海保兴30 L搅拌式电热恒温培养养箱潍坊医疗器械厂全温振荡培养箱哈尔滨市东联电子技术开发有限公司HZQ-F160立式自动电热压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂722光栅分光光度计上海精密科学仪器有限公司SBA-40 C生物传感分析仪山东省科学院生物研究所高效液相色谱仪Agilent 1100美国安捷伦公司液相手性柱三菱化学

4、MCI GEL CRS10W工业葡萄糖山东禹城酵母粉生化试剂，北京奥博星生物技术责任有限公司蛋白胨牛肉膏生化试剂，北京双旋微生物培养基制品厂琼脂粉生化试剂，国药集团化学试剂有限公司1.8 分析方法1 菌体OD值和菌体干重（DCW）的测定发酵液稀释适当倍数，分光光度计于620 nm处测定光密度得到菌体OD值。菌体干重是由光密度通过一个校准方程（DCW = 0.565 OD）转化而来。2 发酵液中葡萄糖和L-乳酸的测定方法发酵液稀释适当倍数后离心，采用生物传感分析仪SBA-40 C测定。糖酸转化率定义为：L-乳酸产量（g/L）/葡萄糖的消耗量（g/L）100。体积生产效率定义为：L-乳酸产量（g/

5、L）/发酵时间（h）。3 L-乳酸的光学纯度测定样品处理：发酵液沸水浴10 min，12000 r/min离心20 min，取上清流动相稀释一定倍数后0.22 m滤膜过滤，HPLC手性柱检测乳酸光学纯度。具体操作条件为：0.002 mol/L硫酸铜作为流动相，流量0.5 ml/min，进样量20 L，紫外检测器，检测波长254 nm，柱温箱温度25。L-乳酸标准品为Sigma-Aldrich公司产品，货号为L1750。D-乳酸标准品为Sigma-Aldrich公司产品，货号为L0625。L-乳酸光学纯度（ee）2 结果与讨论2.1 用PB实验筛选最佳的有机氮源氮源对L-乳酸的发酵生产至关重要，

6、因此有必要挑选合适的氮源。实验的设计和结果见表2.1和表2.2。在表2.2中，每一行代表一次实验，每一列代表一个独立的变量。正号和负号表示高和低两个水平。通过t检验来分析每个变量的显著性水平（表2.3）。拟合的一次方程为：（1）其中，x1, x2, x3, x4, x5, x6, x7是大豆肽（X1）、酵母粉（X2）、大豆蛋白胨（X3）、棉籽蛋白（X4）、蛋白胨（X5）以及豆粕粉（X6）的编码水平；Y是L-乳酸的产量（g/L）。分析结果显示，大豆肽、酵母粉和棉籽蛋白对乳酸发酵生产具有显著影响（显著性水平为99%，P 大豆肽 棉籽蛋白 大豆蛋白胨 蛋白胨 豆粕粉。因此挑选酵母粉、大豆肽和棉籽蛋白

7、进行下一步实验。表2.1 PB实验设计中的因素和水平Table 2.1 Screen for the best nitrogen sources using PB design因素水平变量氮源低 （1）高 （+1）X1大豆肽（g/L）13X2酵母粉（g/L）X3大豆蛋白胨（g/L）X4棉籽蛋白（g/L）X5蛋白胨（g/L）X6豆粕粉（g/L）24表2.2 PB实验设计和结果Table 2.2 Design and results of the PB design实验x1x2x3x4x5x6x7Y （g/L）-122.5 0.735.0 1.430.0 26.5 532.0 2.8634.0 7

8、30.5 822.0 0.0921.0 1024.0 1127.5 1217.5 根据实验数据，我们还使用Fisher检验来分析变异性（ANOVA）。F值和P值分别为26.76和0.0012。整个模型的显著性水平为99.8%。模型拟合的质量通过判定系数（R2）来表示，它的值为0.9698，即意味着有96.98%实验结果的可变性可由这个模型来解释。校正的判定系数（Adj R2 = 0.9336）也很高，也表示了这个模型的高的显著性。这些结果都说明了我们所得到的拟合模型是合适的。表2.3根据筛选实验得到的系数和相应的统计学数值Table 2.3 Coefficients and t values

9、calculated from the screening experiment系数标准偏差t统计量P值Intercept0 = 26.83330.411665.19 0.00011 = 2.16675.260.00332 = 4.583311.130.00013 = 0.66671.620.16634 = 0.91672.230.07655 = 0.33330.810.45496 = 0.33332.2 PB设计方法确定对L-乳酸发酵影响最大的因素除了氮源外，其它因素对L-乳酸生产也有着一定的影响。本实验室的前期研究结果显示，NaNO3、NH4Cl和Mg2+对乳酸发酵有着较为明显的促进作用。

10、另外根据多篇文献报道，维生素中生物素、硫胺素、叶酸和烟酸是凝结芽孢杆菌生长必需的（Campbell and Sniff, 1959; Cleverdon et al., 1949a, 1949b）。但是前期实验表明单加以上一种维生素对发酵的影响不明显。因此，维生素混合液（生物素 20 mg/L, 硫胺素500 mg/L, 叶酸 30 mg/L, 烟酸500 mg/L）也作为下一步PB实验的一个考查因素。实验的设计和结果见表2.4和表2.5。7个因素各取高低两个水平进行实验，在表5中，每一行代表一次实验，每一列代表一个独立的变量。对所得结果进行拟合，拟合的一次方程为：（2）其中，x1, x2, x3, x4, x5, x6, x7是大豆肽（X1