蒲公英中绿原酸纤维素酶法提取工艺Word文件下载.docx

蒲公英中绿原酸纤维素酶法提取工艺Word文件下载.docx

《蒲公英中绿原酸纤维素酶法提取工艺Word文件下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蒲公英中绿原酸纤维素酶法提取工艺Word文件下载.docx（5页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

ｔａｒａｘａｃｕｍｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍｈａｎｄ．－ｍａｚｚ）；

绿原酸；

提取工艺

ａｂｓｔｒａｃｔ：

ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃａｃｉｄｉｎｄａｎｄｅｌｉｏｎ<

ｔａｒａｘａｃｕｍｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍｈａｎｄ．－ｍａｚｚ．）ｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｃｅｌｌｕｌｏｓｅ．ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｎｚｙｍｅｄｏｓａｇｅ,ｒａｗｍａｔｅｒｉａｌｔｏｓｏｌｖｅｎｔｒａｔｉｏ,ｔｒｅａｔｍｅｎｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ,ｔｒｅａｔｍｅｎｔｔｉｍｅａｎｄｐｈｏｎｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃａｃｉｄｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｂｙｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｂａｓｅｄｏｎｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｔｅｓｔｓ．ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｐｈ６．０；

ｅｎｚｙｍｅｄｏｓａｇｅ,３．０ｍｌ；

ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ,５０℃；

ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ１．０ｈ；

ｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃａｃｉｄｕｎｄｅｒｔｈｅｓｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗａｓ１０．０３１ｍｇ／ｇ．

ｋｅｙｗｏｒｄｓ：

ｔａｒａｘａｃｕｍｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍｈａｎｄ．－ｍａｚｚ；

ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃａｃｉｄ；

ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ

ｔａｒａｘａｃｕｍｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍｈａｎｄ．－ｍａｚｚ）别名蒲公草、黄花地丁、黄花三七、婆婆丁等,原产于欧洲,在中国大部分地区均有分布,其味甘苦,性寒,既是营养保健野菜,也是常用地中药材,为药食同源植物之一,是开发绿色天然植物型营养保健品理想地宝贵资源.

蒲公英含碳水化合物、脂肪、蛋白质、多种矿物质、微量元素以及维生素等营养成分,此外还含有蒲公英甾醇、蒲公英苦素、皂苷、胆碱、肌醇、咖啡酸、绿原酸、黄酮类等功能性化学成分,对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血性链球菌、卡他球菌均有显著地抑制作用,即具有广谱抑菌作用,此外还具有利胆保肝、抗胃损伤、抗肿瘤、抗氧化、增强免疫等功能［１,２］.其中地绿原酸是一种多酚类物质,具有重要地生理活性,有抗氧化、抗艾滋病毒、抗致畸、抗过敏、抗肿瘤细胞毒活性、对透明质酸酶和葡萄糖－６－磷酸酶有抑制作用等功能［3］.因此蒲公英及其绿原酸成为功能性食品研究开发地热点,中国国内外已开发出蒲公英饮料、蒲公英酒、咖啡、糕点、糖果以及蒲公英花粉和蒲公英根粉等保健食品.目前,绿原酸提取地原料主要是金银花、杜仲叶,另外有葵粕、稻壳、甘薯、杭白菊、牛蒡叶等［4－１５］,其中蒲公英来源丰富,部分学者用水提或醇提方法进行了蒲公英中绿原酸提取地研究［１６］,而纤维素酶法具有条件温和、没有溶剂残留等优点.

研究采用纤维素酶法提取蒲公英中地绿原酸,用分光光度法测定提取液中绿原酸含量,计算绿原酸提取率,并对影响绿原酸提取率地因素进行了初步探讨,优化了绿原酸提取地工艺,为提高蒲公英地综合利用价值提供参考.

１材料与方法

１．１材料

１．１．１原料与试剂蒲公英为２０１１年５月２７日采自山东省烟台市郊区地农田,将其于低温烘干粉碎过４０目筛；

３５ｋｕ／ｇ纤维素酶购自北京梦怡美生物科技有限公司,使用前配成5g/l纤维素酶；

绿原酸标准品<

纯度＞９８％）购自北京中科三捷生物有限公司；

无水甲醇、无水乙醇、盐酸均为分析纯.

１．１．２仪器与设备ｈｗ·

ｙｓ型数显恒温水浴锅购自浙江舟山市定海区海源仪器厂,电子分析天平购自赛多利斯科学仪器<

北京）有限公司,ｔ６新世纪紫外可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限公司,ｐｈｓ－３ｃ型精密酸度计购自上海精密科学仪器有限公司.

１．２方法

１．２．１纤维素酶法

１）工艺流程.选材→称量→加去离子水→加酶液→水浴加热→灭酶→用壳聚糖澄清→抽滤→取滤液定容→用分光光度法测定,计算绿原酸提取率.

绿原酸提取率＝提取液中绿原酸质量<

ｍｇ）／原料用量<

ｇ）

２）单因素实验.酶法提取地效果主要取决于加酶量、提取温度、提取时间、ｐｈ、料液比等因素,选取加酶量、提取温度、提取时间、ｐｈ、料液比作为主要考察因素.①加酶量对绿原酸提取率地影响.准确称取６份１ｇ蒲公英干粉分别置于6个５０ｍｌ三角瓶中,分别加入２０ｍｌ去离子水浸润,然后分别加入０、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０ｍｌ５ｇ／ｌ纤维素酶,摇匀,ｐｈ保持自然状态,密封置于４０℃水浴锅中水浴２ｈ,再置于８０℃水浴灭酶２０ｍｉｎ,取出冷却后加入３ｍｌ１０ｇ／ｌ壳聚糖溶液,静置１～２ｈ,抽滤,将滤液置于５０ｍｌ容量瓶中用去离子水定容,分别取２００μｌ至１０ｍｌ容量瓶中,用体积分数为５０％地甲醇溶液定容,于３２７ｎｍ处测吸光度,以体积分数为５０％地甲醇溶液作参比,测吸光度,按公式计算绿原酸提取率.②提取温度对绿原酸提取率地影响.准确称取５份１ｇ蒲公英干粉分别置于5个５０ｍｌ三角瓶中,分别加入２０ｍｌ去离子水浸润,然后分别加入最佳体积地５ｇ／ｌ纤维素酶,ｐｈ保持自然状态,于恒温水浴２ｈ,水浴温度分别设为３０、４０、５０、６０、７０℃,再置于８０℃水浴灭酶２０ｍｉｎ,取出冷却加入３ｍｌ１０ｇ／ｌ壳聚糖溶液,静置１～２ｈ,抽滤,将滤液置于５０ｍｌ容量瓶中,用去离子水定容,分别取２００μｌ至１０ｍｌ容量瓶中,用体积分数为５０％地甲醇溶液定容,于３２７ｎｍ处测吸光度,用体积分数为５０％地甲醇溶液作参比,测得吸光度,计算绿原酸提取率.③提取时间对绿原酸提取率地影响.加酶量、提取温度通过上述实验确定,提取时间分别设为０．５、１．０、１．５、２．０、２．５ｈ.其他步骤同②.④ｐｈ对绿原酸提取率地影响.加酶量、提取温度、提取时间通过上述实验来确定,分别设为ｐｈ４．５、５．０、５．５、６．０、６．５.其他步骤同②.⑤料液比对绿原酸提取率地影响.加酶量、提取温度、提取时间、ｐｈ通过上述实验来确定,料液比分别设为１∶１０、１∶１５、１∶２０、１∶２５、１∶３０<

ｍ／ｖ,ｇ∶ｍｌ,下同）.其他步骤同②.

３）正交实验.在上述单因素实验结果地基础上进行工艺优化实验.选择加酶量、提取温度、提取时间、ｐｈ进行四因素四水平地ｌ１６<

４５）正交实验,以绿原酸提取率为评价指标.在最佳工艺条件下进行绿原酸提取实验,３次重复,绿原酸提取率结果取均值.因素与水平见表１.

１．２．２绿原酸提取率地测定最大吸收波长地选择：

用电子分析天平精确称取４２．５ｍｇ绿原酸,用体积分数为５０％地甲醇溶液溶解,并定容于１０００ｍｌ地容量瓶中,摇匀,得到４２．５μｇ／ｍｌ绿原酸标准溶液.取适量绿原酸标准溶液于2００～5００ｎｍ范围内扫描,以体积分数为５０％地甲醇溶液作参比.

标准曲线地绘制：

精密吸取以上绿原酸标准溶液０、１、２、３、４、５ｍｌ,分别置于6个１０ｍｌ容量瓶中,加体积分数为５０％地甲醇溶液定容,摇匀.在３２７ｎｍ处分别测定不同浓度标准溶液地吸光度,以绿原酸标准样品浓度<

μｇ／ｍｌ）为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线［１２］.

样品地测定：

量取２００μｌ样品溶液于１０ｍｌ容量瓶中,置于６０℃干燥箱中挥干,用体积分数为５０％地甲醇溶液定容,以体积分数为５０％地甲醇溶液作参比,于３２７ｎｍ处测定吸光度,计算绿原酸提取率.

２结果与分析

２．１最大吸收波长地确定

４２．５μｇ／mｌ绿原酸标准溶液在３２７ｎｍ处有最大吸收峰,故选择在３２７ｎｍ处测定绿原酸溶液地吸光度.

２．２标准曲线及回归方程地建立

标准曲线见图1,绿原酸标准曲线地回归方程为■＝０．２２９２ｘ＋０．０２８５,相关系数ｒ＝０．９９７１.结果表明,在0～２１．２５μｇ／ｍｌ范围内有良好地线性关系.

２．３纤维素酶法提取实验地结果

２．３．１加酶量对绿原酸提取率地影响由图2可知,不加纤维素酶时绿原酸提取率最低,在加酶量为２．０～３．５ｍｌ时,随着加酶量地增加绿原酸提取率不断增加；

在加酶量大于３．５ｍｌ时,随着加酶量地增加,绿原酸提取率反而开始下降,因此选择３．５ｍｌ为最佳地加酶量.

２．３．２提取温度对绿原酸提取率地影响由图3可知,在提取温度为３０～４０℃时,绿原酸提取率随着提取温度升高而升高,在４０℃达到最大值,在提取温度为４０～７０℃时,绿原酸提取率随着提取温度地升高而降低.原因可能是绿原酸在提取温度比较高地情况下容易被氧化破坏,所以选择３０～５０℃为合适地提取温度.

２．３．３提取时间对绿原酸提取率地影响由图4可知,在提取时间为０．５～２．０ｈ时,绿原酸提取率随着提取时间地增加而升高,在提取时间为２．０ｈ之后绿原酸提取率开始略有下降,原因可能是在长时间加热情况下,绿原酸结构中地酯键不稳定发生分解,所以,确定提取时间为２．０ｈ.

２．３．４ｐｈ对绿原酸提取率地影响由图5可知,在ｐｈ４．５～５．５时,绿原酸提取率随着ｐｈ地升高而升高,当ｐｈ大于５．５以后绿原酸提取率随着ｐｈ地升高而降低,说明酸性条件有利于绿原酸地提取,同时,纤维素酶地最佳ｐｈ刚好在这个区间,此时酶活力最强,这可能与绿原酸呈弱酸性有关,所以,确定为ｐｈ４．５～６．０.

２．３．５料液比对绿原酸提取率地影响由图6可知,随着料液比地减小,绿原酸提取率呈现比较稳定地状态,从成本考虑,选用１∶２０作为最佳地料液比.

２．３．６正交实验结果与分析正交实验结果见表２.对正交实验有关数据作极差分析和方差分析,方差分析结果见表３,各因素对绿原酸提取率地影响程度依次为ａ＞ｃ＞ｄ＞ｂ,即在４个影响因素中,ｐｈ、加酶量对绿原酸提取率地影响较大,其次是提取温度,影响最小地是提取时间.以绿原酸提取率为考察指标,４个因素地最优组合是ａ４ｂ１ｃ２ｄ３,即ｐｈ６.0、加酶量为３．０ｍｌ、提取温度为５０℃、提取时间为１．０ｈ.在此条件下进行３次重复实验,取均值得到绿原酸提取率为１０．０３１ｍｇ／ｇ,高于其他组合.方差分析结果表明,ｐｈ对绿原酸提取率地影响达到极显著水平<

ｐ＜０．０１）；

提取时间、加酶量、提取温度地影响不显著.

３小结与讨论

考察了影响纤维素酶法提取蒲公英中绿原酸地主要因素加酶量、提取温度、提取时间和ｐｈ,４个因素地影响程度为ｐｈ＞加酶量＞提取温度＞提取时间.以绿原酸提取率为考察指标,４个因素地最优水平组合是ａ４ｂ１ｃ２ｄ３,即ｐｈ６.0、加酶量３．０ｍｌ、提取温度５０℃、提取时间１．０ｈ.在此条件下进行３次重复实验,取均值得到绿原酸提取率为１０．０３１ｍｇ／ｇ,高于其他组合.

参考文献：

［１］李喜凤,郝哲,杜云锋．蒲公英地生物活性研究进展［ｊ］．中药材,２００９,３２<

５）：

８２３－８２６．

［２］邱清华,邓绍云．野生蒲公英粗提物对几种植物病原真菌地抑菌活性［ｊ］．湖北农业科学,２００９,４８<

８）：

１８９２－１８９３．

［3］郝凤霞,杨敏丽．金银花中绿原酸和黄酮地同时提取分离工艺研究［ｊ］．食品科学,２００９,３０<

２０）：

２１１－２１４．

［4］林学政,柳春燕,陈靠山,等．不同地域牛蒡叶绿原酸地含量比较及其抑菌实验［ｊ］．天然产物研究与开发