WB原理步骤与总结Word文档下载推荐.docx

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10%分离胶

水3.3mL、30%丙烯酰胺混合液4.0mL、1.0mol/LTris（pH8.8）2.5mL、10%SDS0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED0.004mL

5%浓缩胶

水2.7mL、30%丙烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/LTris0.5mL、10%SDS0.04Ml/10%过硫酸铵0.04mL、TEMED0.004mL

1×

Tris–甘氨酸电泳缓冲液

Tris碱3.03g、甘氨酸18.77g、SDS1g，用去离子水定容至1L

2×

SDS凝胶加样缓冲液

Tris-HCl（pH6.8）100mmol/L，β-巯基乙醇10%，10%甘油，0.01%溴酚蓝，10%SDS

转移缓冲液

Tris2.45g，甘氨酸11.25g，甲醇100mL，加去离子水至1L

TBST

Tris1.21gNaCl8.77g，Tween-201mL，加去离子水至1L

Stripping

1.3mLTris（pH6.8），4mL10%SDS，140µ

lβ-巯基乙醇，用水定容到20mL

实验步骤

1SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

⑴凝胶配置

①分离胶的配置：

将配置好的分离胶液混匀后迅速倒入胶槽中，至距离短玻璃板顶端约2cm处，停止灌胶。

检查是否有气泡，若有用滤纸条吸出。

然后在胶液界面上加蒸馏水进行水封。

15~30min后，凝胶和水封层界面清晰，说明胶已经聚合完全，然后用滤纸吸取水封层，滤纸切勿接触到凝胶面。

（使蛋白样品分离）

②浓缩胶的配置：

将配置好的浓缩胶灌注在分离胶之上，直至短玻璃板的顶端，然后插入样品槽梳子。

室温下浓缩胶聚合，约20~30min。

（使蛋白样品浓缩）

⑵蛋白样品的处理

将蛋白样品溶于样品溶解液，终浓度为0.5~1mg/ml。

然后转移到小离心管中，轻轻盖上盖子（不能塞紧，以免加热时液体迸出），在100℃沸水浴中加热3min，取出冷却后备用，使用前需要将样品离心除去颗粒物质。

暂时用不到的话，可放在﹣20℃冰箱长期保存，使用时沸水浴中加热3min，以除去亚稳聚合态物质。

上样前的样品一定要均匀以防电泳时出现纵向条带。

⑶加样

拔去样品槽梳子，倒入电极缓冲液，没过短板约0.5cm以上，若样品槽中有气泡，用枪头挑除。

按顺序向凝胶样品槽中加入标准蛋白和未知蛋白样品，每孔的加样量要相同，一般加样体积为10~30µ

l，加样时枪头深入到加样槽内，尽量接近底部，记录加样顺序。

⑷电泳

上槽接负极，下槽接正极，打开直流稳压电源，先80V过了浓缩胶后改为120V，待溴酚蓝指示剂迁移到凝胶下沿1cm时停止电泳。

2蛋白质的电转移

⑴水平半干式电转移

①戴乳胶手套剪滤纸6张，滤纸长与宽比SDS—PAGE胶各大1cm。

②裁剪与SDS—PAGE胶长宽相等的NC膜。

③将3张滤纸和SDS—PAGE胶浸在负极转移液中待用。

④将另3张滤纸和NC转移膜浸在正极转移液中待用。

⑤将浸在负极转移液中的滤纸取出，尽量少带液体，置于转移槽负极上，然后在负极滤纸上依次铺放SDS—PAGE胶、NC膜、3张用正极转移液饱和的滤纸。

注意排除气泡，因为气泡会产生高阻抗点，形成低效印迹区，即所谓“秃斑”。

⑥盖上石墨阳极板，设定50mA恒流，转移一定时间。

⑵垂直湿式转移

①凝胶片的平衡：

把电泳后的凝胶从玻璃板上转移至成有适量转移缓冲液的大培养皿中，浸泡30~60min,以除去胶中的SDS，使其pH及离子强度和印迹缓冲液相一致，防止凝胶发生膨胀或皱缩。

②将转移缓冲液冷却至4℃

③准备NC膜和滤纸：

戴乳胶手套裁剪与凝胶大小相同的NC膜和4张滤纸，用转移缓冲液浸润膜和滤纸15min，直到没有气泡，

④将海绵在转移缓冲液中充分浸湿

⑤打开蛋白质转移槽的转移夹，依次放入：

浸湿的海绵，两张用转移缓冲液饱和的滤纸，用转移缓冲液浸过的胶，NC膜，两张用转移缓冲液饱和的滤纸，浸湿的海绵，然后合上转移夹。

⑥转移槽中倒入转移缓冲液，然后将转移夹置于槽中，凝胶靠近负极NC膜靠近正极

将转移槽放到4℃冰箱内，电转移，恒流80mA，4h。

3免疫印迹分析

⑴NC膜上总蛋白的染色和脱色：

将电泳转移完后的NC膜取出，置于培养皿中。

丽春红S染色3min后，用铅笔轻轻标出标准蛋白带的位置以备计算特异性蛋白质相对分子质量所需。

然后，用丽春红S脱色液轻轻漂洗数次至红色消失。

⑵特异性抗体检测

①脱色后的NC膜置于培养皿中，加入封闭液，并在水平摇床上不断振摇，室温下封闭2h以上。

（将膜上未结合目的蛋白的区域封闭以防止一抗的结合）

②倒出封闭液，加入漂洗液，水平摇床上不断振摇，洗膜3次，每次5min。

（除去封闭液）

③漂洗完后，将膜转移至杂交袋中，加入特异性一抗，4℃摇床过夜或室温放摇3h（一抗与目的抗原蛋白特异性结合）

④利用水平摇床，用TBST洗膜3次，每次5min。

（洗去未结合的一抗）

⑤将膜转移到稀释的酶标二抗中，在室温下孵育30min

⑥倾去二抗，用TBST洗膜，室温摇洗三次，每次5min，蛋白面朝上，置于保鲜膜中，将ECL的A液和B液以1:

1体积混合，于暗室中，按0.05-0.1ml/㎝2的量滴加于膜表面，孵育1min，滤纸吸去多余液体用保鲜膜包好，立即于暗室内曝光数秒。

在暗室中，将1×

显影液和定影液分别到入塑料盘中；

在红灯下取出X－光片，剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；

打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；

根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。

显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；

显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；

用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。

注意事项

①在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性；

②不同浓度的凝胶用于分离不同相对分子质量的蛋白

③选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键、二硫键；

对于多亚基蛋白或含多条肽链的蛋白，SDS—PAGE只能测定它们的亚基或单条肽链的相对分子质量。

④尽量除去核酸、多糖、脂类等干扰分子；

⑤蛋白质样品在处理过程中应低温下进行，以避免细胞破碎释放出各种酶对其进行修饰

⑥尽量使用新鲜的loadingbuffer，样品要与loadingbuffer混合均匀，

⑦不可将蛋白质反复冻融使用以防改变蛋白质的抗原特性，

⑧Buffer一定要漫过梳子孔，否则可能会发现蛋白跑不动；

⑨电泳时先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，特别是对于高分子量的目的蛋白，

⑩硝酸纤维素（NC）膜：

NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小；

非特异性本底显色浅；

价格低廉，使用方便。

但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失；

NC韧性较差，易损坏。

聚偏二氟乙烯（PVDF）膜：

与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。

但价格上稍贵。

为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小要先将膜晾干，然后浸入20%的甲醇，待完全浸湿后取出透光观察即可看到蛋白条带（适用于PVDF膜）。

传统方法是将膜用1×

丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇），然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。

从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。

高背景可能的原因：

膜未均匀浸泡；

膜或缓冲液污染；

封闭不充分；

抗体与封闭液出现交叉反应；

抗体浓度过高。

解决方法有：

转膜前用100%甲醇将膜完全浸泡；

杂交前检测一抗、二抗；

检测一抗、二抗与封闭液是否有交叉反应。

转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。

转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。

也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。

作用

定性分析蛋白质，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量，分析目的蛋白表达的特异性。

蛋白样品的制备

（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：

　1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。

　　2、每瓶细胞加3ml4℃预冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。

平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。

重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。

将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

　　3、按1ml裂解液加10μlPMSF（100mM），摇匀置于冰上。

（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。

）

　　4、每瓶细胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

　　5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。

（整个操作尽量在冰上进行。

　　6、于4℃下12000rpm离心5min。

（提前开离心机预冷）

　　7、将离心后的上清分装转移到离心管中放于－20℃保存。

（2）组织中总蛋白的提取：

　　1、将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

　　2、加400μl单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。

然后置于冰上。

　　3、几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。

　　4、裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。

　　（3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：

　　由于受药物的