细胞实验的基本操作.docx

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细胞实验的基本操作

细胞实验的根本操作

【细胞培养】

一、细胞的复苏:

非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。

细胞复苏的原那么快速融化：

必须将冻存在一196°C液氮中的细胞快

速融化至37°C,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，防止冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

具体操作如下：

1、实验前准备：

1.R将水浴锅预热至37°C,并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。

1.2、用75%酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。

1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。

2、取出冻存管及迅速解冻：

2、1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。

2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000〜1500rpm离心3分钟；

4、制备细胞悬液吸去上清液，参加10ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；

5、细胞计数细胞浓度以5X105/ml为宜。

6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37°C和5%C02的培养箱内培养〔略微拧松培养瓶盖〕，换液的时间由细胞情况而定。

通常，除少数特别注明对DMS0敏感的细胞外，绝大局部细胞株〔包括悬浮性细胞〕，在解冻之后，可直接放入含有10-15mI〔5-10倍〕新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMS0即可，如此可防止大局部解冻后细胞无法生长或贴附的问题。

二、细胞的传代：

培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累〔可见到培养液变黄〕，而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。

这时就需要别离出一局部细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。

1、贴壁细胞的传代

具体操作如下：

1.1、传代前准备：

1.1.1.预热培养用液：

把装有培养液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37°C水浴锅内预热。

1.1.2.用75%酒精擦拭双手和经过紫外线照射的超净工作台

1.1.3.正确摆放使用的器械：

保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。

1.1.4、点燃酒精灯：

注意火焰不能太小。

1.1.5、准备好将要使用的已灭菌的空培养瓶。

1.1.6.取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好前方能放入超净台内。

1.1.7.从培养箱内取出细胞，注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察

细胞，并做好记录。

1.1.8.细胞培养瓶经用75%酒精擦拭后，再放入超净台。

1.2、胰蛋白酶消化：

1.2、1.将瓶盖过酒精灯火焰消毒后，翻开瓶盖，靠近酒精灯，小心吸出旧培养液，用PBS清洗2—3次，沿

壁〔无细胞的一面〕缓缓参加适量消化液〔胰蛋白酶液〕，轻轻摇晃。

注意消化液的量以盖住细胞最好，最

佳消化温度是37°Co

、显微镜下观察细胞：

倒置显微镜下观察消化细胞，假设胞质回缩，细胞之间不再连接成片，说明此时

细胞消化适度。

1.3、吹打分散细胞:

1.3.k弃去大局部消化液〔仅留少量在瓶内〕，并轻轻拍打培养瓶，使细胞分散，然后参加新鲜的培养液，

再用吸管轻轻吹打成细胞悬液〔尽可能不要出现泡沫，否那么对细胞有损伤〕

1.4.分装稀释细胞

1.4.R将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，参加适量培养基旋紧瓶盖。

、倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。

注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应

该不低于5X105/mlo最后在瓶上做好标记，如细胞代数、日期及姓名等。

1.5.继续培养：

1.5.R用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入C02培养箱中继续培养。

传代细胞2小时后开始贴附在

瓶壁上。

当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25%时为一个+,占50%为++,占75%时为+++o

2、悬浮细胞的传代

悬浮细胞可以直接将培养瓶中的液体吸掉，只留下少量，然后参加新鲜培养液即可。

当细胞悬液中碎片或颗粒物较多，感觉到比拟脏时，可以将悬液移到离心管内，1000〜1500rpm离心3分钟，弃上清，参加约2ml培养液，吹打至均匀，滴加2-3滴至已参加新鲜培养液的培养瓶中。

然后置于二氧化碳培养箱中培养

〔拧松培养瓶盖〕。

三、细胞的冻存

细胞冻存的原那么是要逐步缓慢降温，以防止细胞内部形成冰晶对细胞造成伤害。

k具体操作如下：

1.1.从增值期到形成致密单层以前的细胞都可以用于冻存，但最好选择对数增长期细胞，已长满的细胞冻存复苏后生存率低。

在冻存前一天最好换一次培养液。

1.2、贴壁细胞经消化、离心〔1000〜1500rpm,5min〕收集，悬浮细胞经离心收集；

1.3、大约106个细胞参加1ml冻存液〔10%DMS0+90%血清〕,用吸管吹打，使细胞分散成单细胞悬液；

1.4、参加到冻存管中，每个冻存管加1—1.5ml的细胞悬液；密封；

1.5、在冻存管上标明细胞名称及冻存日期；

1.6、将冻存管直立放置于塑料盒或纸盒内，管置于4°C半小时，然后置于-20°C两小时，再置于-709两小时，然后置于液氮上方过夜；第二天将细胞置于液氮中；

1.7、记下冻存管存放的位置，作好冻存记录〔冻存的细胞名称、代数、冻存日期等〕。

2、考前须知：

2.1、使用DMS0前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。

高压灭菌反而会破华它的分子结构，以

至于降低冷冻保护效果。

在常温下，DMS0对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。

2.2、不宜将冻存细胞放置在0°C〜-60C这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危

险温区〞。

2.3、注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。

2.4、细胞在液氮中贮存的时间理论上是无限的。

但为妥善起见，特别是很多未被冻存过的细胞在首次冻存

后要在短期内复苏一次，观察细胞对冻存的适应性。

已建系的细胞最好也每年取一支复苏一次后，再继续

冻存。

四、细胞计数

实验原理：

当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。

具体操作如下：

1、准备工作：

取一瓶传代的细胞，按上述二的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以使用。

2、细胞悬液制备：

细胞悬液的制备方法：

用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，参加培养液〔或Hanks液或PBS等平衡盐溶液〕,吹打制成待测单细胞悬液。

3、细胞计数：

2.1、盖好盖玻片：

取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。

2.2、制备计数用的细胞悬液：

用吸管吸适量细胞悬液〔如5滴〕到一离心管中,参加等体积台盼蓝染液〔0.4%〕或苯胺黒，活细胞不会被染色，参加染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。

假设仅是单纯的进行细胞计数，不考虑细胞的活力，那么可省略台盼蓝染色步骤。

2.3、、将细胞悬液滴入计数板：

将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。

2.4、统计四个大格的细胞数：

将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格〔每个大格含有16个中珞〕中没有被染液染上色的细胞数目。

2.5、计算原细胞悬液的细胞数：

按照下面公式计算细胞密度：

〔细胞悬液的细胞数〕/ml=〔四个大格子细胞数/4〕X2X104

说明：

公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。

公式中乘以2因为细胞悬液于染液是仁1稀释。

公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：

1.0mm〔长〕X1.0mm〔宽〕X0.1mm〔高〕=0.1mm3;而1mI=1000mm3

细胞计数要点：

1进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml,如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培

养液中；

2要求细胞悬液中的细胞分散良好，否那么影响计数准确性。

3取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时屡次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；

4数细胞的原那么是只数完整的细胞，假设细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。

如果细胞压在格线上时，那么只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。

5操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否那么要重新计数。

注：

4%台盼蓝母液的配制：

称取4克台盼蓝，参加少量蒸徭水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤，4°C保存。

使用时，用PBS稀释至0.4%。

五、细胞活力的测定

1.染料排斥试验：

其原理是细胞损伤或死亡时，某些染料可穿透细胞膜，和解体的DNA结合，使其着色。

而活细胞那么能阻止该染料进入细胞内。

借此可鉴别死细胞和活细胞。

常用的染料有台盼蓝、伊红Y和苯胺黑等。

以台盼蓝染色为例。

步骤同上述细胞计数的操作步骤。

注意以下几点：

1计数：

在3—10min内，用血球计数板分别计数活细胞和死细胞〔死细胞被染成淡蓝色，活细胞那么拒染〕。

2台盼蓝染色时，时间不宜太长，否那么活细胞也会着色，从而干扰计数。

3活细胞率〔％〕=活细胞总数/〔活细胞总数+死细胞总数〕X100%

2、MTT比色实验：

可测定测药物或病毒的IC50

原理：

活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶催化四甲基偶氮哇盐〔MTT〕,复原成紫色不溶性结晶物，沉积于细胞中。

用酸性异丙醇或DMS0溶解后，于酶标仪上测定光吸收值。

紫色不溶性结晶物形成的多少和活细胞数目和功能状态相关。

2.1、将细胞接种于96孔板上，密度为大约105个/ml,每孔接种100|iI;

2.2、培养至对数生长期参加待测样品；

2.3、作用一定的时间之后，参加三蒸水配制的5^g/mI的MTT溶液，每孔20口

I：

2.4、37°C温育4小时；

2.5、取出培养板，小心吸去上清，注意不要吸掉底部的蓝紫色沉淀；如果是悬浮细胞那么用板离心机离心后除去上清；

2.6、每孔参加100|iI的DMSO,摇床上摇动30分钟以使沉淀溶解；

2.7、用酶联免疫检测仪〔DNAExpert〕在595nm〔或490nm〕波长处检测96孔平板中每孔细胞的光密度值

〔0D值〕，按以下公式计算药物或病毒对细胞生长的抑制率:

在所得的曲线上,下细胞的存活率,

〔或病毒〕浓度下的0D值占对照0D值的百分比，用此百分比浓度作图；百分比值为50时所对应的浓度就是IC50值。

或根据各浓度采用Logit法计算IC50o

六、细胞的运输

装运细胞的方法有两种:

1、冷冻贮存运输

即利用特殊内内盛液氮或干冰冻存，保存效果较好，但较麻烦，且不能长时间运输，多需空运。

2、充液法

2.1、选生长状态良好的细胞，去掉培养液，充满新培养液，液量要到达培养瓶颈部，拧紧螺帽或塞以胶塞，

保存微量空气。

假设空气留量过多，运输时大气泡来回流动对细胞有干扰作用。

2.2、妥善包装、运输。

一般在四五天内到达目的地，对细胞活力无多大影响，时间过长那么细胞活力下降。

2.3、到达目的地后，倒出大局部培养液，保存维持细胞生长所需的液量，置37°C培养，次日传代。

注：

从其他研究室所取细胞时，应注意了解细胞的性状、培养液、培养时的注意事项等

【细胞转染】

一、脂质体转染〔Lipofetmiane2000〕

k转染前细胞的处理〔以24孔板培