正交试验优选大孔树脂分离连翘酯苷的工艺Word格式.docx

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正交试验

Extractiontechnologyofforsythiasidefromfructusforsythiaebythemethodoforthogonaltestoptimizationandseparationthroughmacroporousresin

【Abstract】ObjectiveTodesigntheextractionandseparationtechnologcialconditionsofforsythiasidefromFructusForsythiae.MethodsThesolventofextractionwasinvestigated.Theorthogonaltestmethodwasadoptedtoinvestigatetheeffectofthe4factors,whichincludetheconcentrationandvolumnofalcohol,thetimeandthetimesofextractionandtheprocessofabsorptionseparationthroughmacroporousresincolumnontheyieldingrateofforsythiasidefromFructusForsythiae.ResultsTheoptimumextractionconditionwere:

extracting3timeswith70%alcohol,1.5heachtimewith7timesthevolumeofthealcohol.Theeluentwas40%alcohol.ConclusionTheresultsindicatethattheyieldingrateofforsythiasidefromFructusForsythiaewasfrom9.1%to10.6%bythistechnology.Theconcontrationofforsythiasideinextractwasfrom18%to22%,sothistechnologyissuitableforindustrialproduction.

【Keywords】fructusforsythiae;

extractingprocess;

orthogonaltest

连翘为木犀科植物连翘Forsythiasuspensa（Thunb.）vahl的干燥果实。

连翘中所含成分主要为连翘酯苷（forsythiaside）［1,2］、连翘苷（phillyrin）［3］、挥发油［4］、黄酮类等。

其中，含量较高且药理活性较强的成分是连翘酯苷，其对金黄色葡萄球菌等11种细菌有极强的抑制作用，是连翘抗菌、抗病毒的主要有效成分之一［5］。

故本文以连翘酯苷含量为指标，考察了提取溶媒。

确定提取溶媒后，采用正交试验进行提取工艺优化，提取物进一步用大孔树脂分离纯化，从而系统的研究了连翘提取和分离纯化工艺。

1仪器与试药

Waters高效液相色谱仪（616泵，996二极管阵列检测器；

717自动进样器，2010色谱管理系统）；

甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；

水（重蒸馏水，自制）；

磷酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；

连翘酯苷对照品（沈阳药科大学徐绥绪教授提供）。

2方法与结果

2.1提取溶剂的选择连翘中含量最高抗菌活性最大的成分为连翘酯苷，其结构中含双糖基和咖啡酰基，极性较大，在水和含水乙醇中溶解性极好。

因此分别选择以水为溶媒的煎煮法和以70%乙醇为溶媒的回流提取法，比较二者优劣，含量测定结果见表1表1不同溶剂提取的结果结果表明：

70%乙醇对连翘酯苷的提取率较水高，故选择醇提取法。

2.2醇提取工艺优化的研究采用正交试验法对乙醇提取工艺中的加醇量、回流时间、回流次数、醇浓度进行考察，方法与结果如下。

2.2.1正交设计表见表2。

表2L9（34）因素水平表

2.2.2正交试验及结果见表3。

表3正交试验结果

2.2.3方差分析表见表4。

表4方差分析表注：

F0.05（2.2）=19，F0.01（2.2）=99

2.2.4结果由正交试验结果可知，回流次数和醇浓度对收率和连翘酯苷含量有极显著影响，回流时间对其有显著影响，而加醇量对结果影响很小，将其并入误差相。

影响因素的显著性大小依次为C&

gt;

D&

B&

A。

最佳提取工艺为A2B2C3D2，即：

加7倍量70%乙醇，回流提取3次，每次1.5h。

2.3大孔吸附树脂的选择最佳提取工艺获得的提取物，上样于大孔树脂柱上。

试用了A型、B型、C型3种大孔吸附树脂，上样后以水洗至洗脱液无色，蒸干后固型物用聚酰胺薄膜层析检测，A型树脂吸附能力过强，B型稍有泄漏，C型泄漏严重，故选择A、B型混合使用，通过试验确定二者最佳比例。

试验结果见表5。

表5大孔树脂选择结果结果表明：

树脂A型和树脂B型用量比为1：

1时最适宜。

大孔树脂洗脱物的收率为9.1%～10.6%（以药材计），连翘酯苷的含量为18.3%～22.5%。

2.4连翘提取物中连翘酯苷含量测定

2.4.1标准曲线的绘制精密称取连翘酯苷对照品1.87mg，以甲醇制成每1ml含0.187mg的溶液，作为对照品溶液。

分别取对照品溶液2、4、6、8、10μl，分别进样5次，测得峰面积平均值，以进样量X（μg）为横坐标，峰面积积分值Y为纵坐标，绘制标准曲线，Y=760201.07X-4361.40（r=0.99998），线性范围：

0.374～1.87μg。

2.4.2样品溶液的配制取连翘提取物5～30mg，精密称量，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，混匀后取适量离心，上清液供HPLC法用。

2.4.3色谱条件色谱柱：

NovapakC18柱（3.9mm×

150mm）；

流动相：

甲醇-水-磷酸（40：

60：

0.1）；

流速：

0.8ml/min；

检测波长：

328nm；

柱温：

室温；

衰减：

6；

进样量：

5μl。

2.4.410批样品（大孔树脂洗脱物）含量测定结果见表6。

表6连翘提取物中连翘酯苷

3讨论

（1）连翘有青翘和老翘之分，据文献报道及实验测定结果知，青翘中连翘酯苷含量较老翘高，且连翘叶、连翘心、连翘壳中均含有连翘酯苷，其中连翘壳中含量最低，叶和心中含量较高［6］，故本项研究所用连翘为青翘且无需去心（种子）。

（2）连翘酯苷为连翘抗菌和抗病毒的主要成分之一，含量较高且抗菌谱广。

以其作为指标能较好的反应连翘（及以连翘为主要成分的制剂）的质量和疗效。

但由于连翘酯苷的对照品不易获得［7］（得到纯品难度大、稳定性较差、遇酸碱易氧化、易水解）。

故现在有部分文献仍然以连翘苷来作为连翘的定量标准。

（3）连翘为精制双黄连气雾剂中的君药，本文对连翘进行提取和分离纯化工艺的研究，为完善精制双黄连气雾剂的制备工艺奠定了基础。

（4）大孔（吸附）树脂属于功能高分子材料，在干燥状态下其内部具有较高的孔隙率，且孔径较大，在100～1000nm之间。

20世纪60年代末出现了合成的大孔吸附交换树脂，并于70年代末用于中草药有效成分的分离提纯。

大孔树脂具有表面积较大、交换速度较快、机械强度高、抗污染能力强、热稳定好、在水溶液和非水溶液中都能使用的特点。

另外成本较低，也是笔者选择大孔树脂树脂分离纯化连翘酯苷的一个重要原因。

笔者试用了A型、B型、C型3种大孔吸附树脂，或是吸附能力过强，或是有泄漏，均未得到满意结果。

原因可能是由于各类大孔树脂对成分的吸附特征不同，吸附量差别也很大，很难用一种树脂将连翘酯苷分离出来，故笔者采取A型、B型两种树脂联合应用，通过试验。

摸索出A型、B型的最佳混合比例为1:

1，在此比例下用40%乙醇洗脱能得到较满意的分离效果。

【参考文献】

1MingDS,YuDQ,YuSS.TwonewcaffeyolglycosidesfromForsythiasuspensa.JAsianNatProdRes,1999,1（4）:

327-335.

2宣小龙，史远刚.中药连翘酯苷成分的提取和薄层层析检测.安徽农业科学，2006，34（6）：

1114-1116.

3廖朝峰，胡志军，谢红亮.HPLC法测定双黄连胶囊中连翘酯苷A及连翘苷的含量.中国药师，2005，8（5）：

385-386.

4张海燕.连翘化学成分及药理活性的研究进展.中药材，2000，23（10）：

657-660.

5胡克杰，徐凯建，王跃红，等.连翘酯苷体外抗病毒作用的实验研究.中国中医药科技，2001，8

（2）：

89.

6梁文藻，傅晓勇，徐国士.连翘成分分析IV连翘酯苷的分离、鉴定和测定.药物分析杂志，1986，6（5）：

263-266.

7张立伟，杨颖.连翘酯苷稳定性研究.中成药，2003，25（5）：

353-356.