PCR荧光检测试剂盒生产质控规程Word文档下载推荐.docx
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7．边加边看,直观估计,防止跳管。
8．低温冷藏批量DNA提取液、PCR反应液A和B取出时是否充分混匀后,分装使用，PCR反应液A和B是否避光低温冷藏和使用。
9．配PCR反应液应先加缓冲液再加PCR反应液充分混匀,必要时倒置混匀,再离心,或用灭菌吸头上下吸几次。
10．PCR反应液（包括样品）应充分混匀:
保证PCR反应曲线呈S形，全阴性样品呈近似水平曲线。
二．PCR试验操作规程
程序
操作
检查
1
混匀方法
每一次提醒注意
倒置混匀、移液器吹打、震荡，50000rpm离心1分钟。
2
取血清样本
1）因水分蒸发变浓
2）冻状、混浊
按
（1）法混匀,再取25µ
l加水5µ
l混匀。
温水浴37℃溶解按
（1）法混匀,或12000rpm离心5分钟，取清液。
3
取质控品
冻状、混浊
温水浴37℃溶解按
（1）法混匀或12000rpm离心5分钟，取清液。
4
血清样本稀释
混匀血清
阴性血清40µ
l加阳性血清10µ
l，按
（1）法混匀。
5倍稀释
5
质控品稀释
混匀质控品
血清稀释液40µ
l加质控品10µ
l，按
（1）法混匀5倍稀释。
6
血清样本DNA提取
DNA提取液完好
血清样本按
（1）法混匀，取30µ
l加DNA提取液60µ
l，按
（1）法混匀，98℃8分钟变性,0℃冷却2-3分钟，12000rpm，离心10分钟,吸取上清液。
7
质控品DNA变性
分装，有效，呈清液状态，未反复加热、冻融
质控品按
（1）法混匀，取30µ
l5000rpm离心1分钟，98℃5分钟变性,5000rpm，离心1分钟,吸取上清液。
8
PCR反应液
混匀状态
取25µ
l反应液加5µ
l提取DNA，按
（1）法混匀，5000rpm离心1分钟，5000rpm，离心1分钟,吸取上清液。
9
PCR反应
室温10-30℃
PCR反应槽四角不放管。
10
设阴性对照
阴性混匀血清
CT〉38
11
阳性参考品
各浓度呈梯度
以PCRA反应液制作标准曲线，呈直线。
12
阴性质控品B
以PCRA和B反应液制作标准曲线，呈直线。
**血清稀释液：
全阴性血清再加2倍HBVDNA提取液混匀,5000rpm，离心1分钟，混匀血清98℃5分钟变性,12000rpm，离心10分钟,吸取上清液。
三.超净工作台的使用、维护保养与清洁标准操作规程
1.目的
建立一个超净工作台的使用、维护保养与清洁标准操作程序，使操作过程标准化。
2.职责
质量部QC负责本文件的起草，质量部及QC检验人员负责本标准的实施。
3.范围
本标准适用于超净工作台的使用、维护和保养与清洁。
4.内容
超净工作台的主要组成部分：
高效过滤器、中效过滤器、通风机、电气控制及排气管道部分。
安放点的选择：
4.2.1应安放于卫生条件较好的地方，便于清洁，门窗能够密封以避免外界的污染空气对室内的影响。
4.2.2安放位置应远离有震动及噪音大的地方。
4.2.3严禁安放在产生大尘粒及气流大的地方，以保证操作区空气的正常流动。
使用前的检查：
4.3.1接通超净工作台的电源。
4.3.2旋开风机开关，使风机开始正常运转，这时应检查高效过滤器出风面是否有风送出。
4.3.3检查照明及紫外设备能否正常运行，如不能正常运行则通知工程部检修。
4.3.4工作前必须对工作台周围环境及空气进行超净处理，认真进行清洁工作，并采用紫外线灭菌法进行灭菌处理。
4.3.5净化工作区内严禁存放不必要的物品，以保持洁净气流流动不受干扰。
使用：
4.4.1使用工作台时，先经过清洁液浸泡的纱布擦拭台面，然后用消毒剂擦拭消毒。
4.4.2接通电源，提前50分钟打开紫外灯照射消毒，处理净化工作区内工作台表面积累的微生物，30分钟后，关闭紫外灯，开启送风机。
4.4.3工作台面上，不要存放不必要的物品，以保持工作区内的洁净气流不受干扰。
4.4.4操作结束后，清理工作台面，收集各废弃物，关闭风机及照明开关，用清洁剂及消毒剂擦拭消毒。
4.4.5最后开启工作台紫外灯，照射消毒30分钟后，关闭紫外灯，切断电源。
4.4.6每二月用风速计测量一次工作区平均风速，如发现不符合技术标准，应调节调压器手柄，改变风机输入电压，使工作台处于最佳状况。
4.4.7每月进行一次维护检查，并填写维护记录。
清洁
4.5.1每次使用完毕，立即清洁仪器，悬挂标识，并填写仪器使用记录。
4.5.2取样结束后，先用毛刷刷去洁净工作区的杂物和浮尘。
4.5.3用细软布擦拭工作台表面污迹、污垢目测无清洁剂残留，用清洁布擦干。
4.5.4要经常用纱布沾上酒精将紫外线杀菌灯表面擦干净,保持表面清洁,否则会影响杀菌能力.
4.5.5效果评价:
设备内外表面应该光亮整洁，没有污迹。
四.检验方法操作规范
1.混匀：
反应液混匀，按人份量取出，加样，再混匀后5000rpm离心数秒（按原说明进行）。
2.准确：
反应液及样本混匀后,每一步加样准确（按原说明进行）。
3.新鲜血清样本：
血清样本混匀后离心（5000rpm离心数秒），取30μl，加2倍量DNA提取液60μl混匀100℃8--9分钟变性，放置冰箱0℃冷却2-3分钟,12000rpm离心5分钟，取出全部上清液置另1管混匀，再取5μl加样。
4.长期放置冰箱冷藏血清样本：
取25μl，加无菌水5μl加2倍量DNA提取液60μl混匀98℃8--9分钟变性，放置冰箱0℃冷却2-3分钟,12000rpm离心5分钟，取出全部上清液置另1管混匀，再取5μl加样.
5.DNA提取液处理并冷藏保存血清样本：
DNA提取液处理：
血清样本混匀，取200μl，加DNA提取液400μl混匀98℃5分钟变性，放置冰箱0℃冷却2-3分钟,12000rpm离心5分钟，取出全部上清液置另1管混匀，冷藏保存，按100μl/管分装冷藏保存.
保存血清样本使用：
取1管分装冷藏保存血清样本，融化后混匀，5000rpm离心数秒，再取30-40μl98℃5-6分钟变性，放置冰箱0℃冷却2-3分钟,5000rpm离心数秒，再取5μl加样.
6.质粒DNA有关质控品（P和N）：
用全阴性血清与质粒DNA按9:
1混匀,5000rpm，离心1分钟,再加2倍HBVDNA提取液混匀,5000rpm，离心1分钟，混匀血清98℃5分钟变性,12000rpm，离心10分钟,吸取上清液,取出全部上清液置另1管混匀，冷藏保存，按100μl/管分装冷藏保存.
有关质控品使用：
取1管分装冷藏保存质控品，融化后混匀，5000rpm离心数秒，再取30-40μl98℃5-6分钟变性，放置冰箱0℃冷却2-3分钟,5000rpm离心数秒，再取5μl加样.
五.防止荧光定量PCR产物污染的质控规程
1.目的
规范荧光定量PCR实验和生产的操作过程，确保操作过程中无PCR产物污染。
2.适用范围
本规范适用于荧光定量PCR实验和生产的操作过程。
该规程参照中华人民共和国《艾滋病核酸检测技术规范》。
3.职责划分
操作人员按照此标准操作规范进行荧光定量PCR实验和生产，质检部经理负责监督。
4.质量保证体系
实验室和生产工作区质控体系
4.1.1实验室和生产工作区原则上应分为四个独立工作区，分别是试剂准备区（GMP车间超净工作室）、样品处理区（质检室1）、扩增区（质检室2）和扩增产物分析区（质检室3）。
前两区为扩增前区，后两区为扩增后区。
各区的功能是：
（1）样品处理区：
样品登记、分装。
各种组织匀浆或细胞裂解，进行核酸提取、保存和加样。
（2）试剂准备区：
PCR扩增试剂的配制、分装和保存。
（3）扩增区：
普通PCR扩增及荧光定量PCR扩增。
（4）扩增产物分析区：
PCR扩增产物的电泳、杂交、成像、测定、结果分析、报告。
4.1.2用有效的方法对操作区域和共用器具在实验前后进行清洁及消毒
推荐的程序是：
a.实验前将次氯酸钠溶液或70%乙醇涂布于操作台或器具表面，两分钟后用纸巾擦除。
b.移入盛放污染材料的器皿、所需的试剂、耗材和样品，进行试验。
c.一个实验区域在同一时间段只进行一种实验。
d.实验结束后移出个人专用材料至个人专用区域保管；
封好污染材料盛放
器皿并移出至污物袋；
移出共用器具至专门区域保管；
将次氯酸钠溶液或70%乙醇涂布于操作台或器具表面，两分钟后用纸巾擦除；
打开紫外灯照射至少15分钟。
4.1.3实验工作区内必须穿好实验工作服，并戴口罩，进行实验操作时根
据要求戴不同规格的手套。
4.1.4PCR产物分析使用相对封闭的系统或共用分析软件时，如特定的凝胶成像分析检测系统及分析软件或荧光定量PCR仪及分析软件，每位实验人员都要准确的命名自己的设置程序及分析结果，使用完毕后需收拾好所用的仪器并保存好自己的实验分析结果。
4.1.5各区域的仪器、设备、器具和试剂应为该区专用，不得交叉使用。
荧光定量PCR扩增实验过程控制体系：
4.2.1样品的采集和处理
4.2.1.1用于普通PCR或荧光定量PCR检测的样品有细胞、全血、血浆、各种组织和其他分泌物，有时还包括生物制品。
4.2.1.2采集样品应避免微生物和核酸污染（所用器皿必须无菌或属于一次性用品，RNA类样品所用器皿必须没有RNA酶污染）。
4.2.1.3处理样品应在样品处理区由专人进行。
处理和保存用于抽提DNA或RNA的样品应避免DNA或RNA酶造成的降解，通常要求在采样后1小时内处理并低温保存。
4.2.1.4处理后的样品应分装、标记（需用防水的笔填写），并做好实验记
录，冻存于-20℃以下，DNA或RNA类样品应冻存于-60℃或保存在液氮中。
4.2.2核酸（RNA/DNA）提取
4.2.2.1应在规定的区域内由专人按相应程序进行。
4.2.2.2应保证无细菌及核酸污染，实验材料和容器应经过消毒处理并一次性使用。
4.2.2.3提取RNA时应避免RNA酶污染，抽提RNA样品实验使用的移液器及离心管等用品必须用DEPC处理，去除RNA酶。
4.2.2.4配制RNA逆转录或DNA反应试剂，所有操作超过10分钟时应将反应管置于冰盒内，防止各种酶及样品DNA或RNA降解。
4.2.3.3进行逆转录反应时应避免RNA酶污染，实验使用的移液器及离心管等用品必须用DEPC处理，去除RNA酶。
4.2.3.4扩增仪应预热，时间不少于20分钟。
4.2.3.5进行内参基因的扩增（β－actin或GAPDH），并设置递增PCR循环数，电泳确定逆转录的效率及CDNA样品的起始浓度，为荧光定量PCR实验做准备，成功的逆转录样品在
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