蛋白类药物生产要点Word下载.docx

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促性腺激素包括人绒毛膜促性腺激素（HCG）、血清促性腺激素（SGH）等。

其他蛋白质激素包括胰岛素、胰抗脂肝素、尿抑胃素等。

（一）生长素（growthhormone，GH）

生长素是动物脑垂体前叶外侧的特异分泌细胞分泌的一种促进生长的蛋白质激素，具有调节生长与发育的功能，对多种人类疾病有很好的疗效。

人生长素（humangrowthhormone，hGH）由一条191个氨基酸的多肽构成的一链多肽的球形蛋白质，分子中含两条二硫键，分子量为21700，等电点4.9，沉降系数S20，W2.179，其活性不需要整个分子结构，N端1～134氨基酸为活性所必需，C端的肽链起到保护作用，其化学结构与催乳素近似，故生长素有弱催乳素作用，而催乳素有弱生长素作用。

生长素包含大小两个环，以亲水球蛋白的形式存在。

不同种类动物的生长素，其化学结构与免疫性质等都有较大差别。

生长素的生产工艺有传统的方法和基因工程技术方法。

1．生长素的传统生产方法

传统方法是从脑垂体前叶分离纯化，其生产工艺见图11-1所示。

传统的工艺过程如下:

材料获取处死动物，立即解剖，取出脑垂体，冰上速冻，-20℃冷冻保存。

预处理脑垂体使用前，用蒸馏水冲洗数次，解冻，剥离前后叶。

匀浆取动物垂体前叶，分割成小块，加水，用硫酸铵调pH至5.5，置组织捣碎机中匀浆。

提取对匀浆以水抽提，10000rpm离心30min；

取沉淀，以pH4.0的0.1mol／L硫酸铵溶液抽提，离心（同上），取沉淀，再用pH5.5的0.25mol／L的硫酸铵溶液抽提，离心，取上清抽提液。

沉淀调节抽提液pH7.5，加饱和硫酸铵溶液至硫酸铵浓度为lmol／L，离心，取上清液。

再沉淀对上清液再加饱和硫酸铵溶液至1.8mol／L，离心，得沉淀。

⑦除盐将沉淀溶于少量蒸馏水中，对蒸馏水进行透析，得透析内液。

⑧等电点沉淀将所得透析内液用HCL或NaOH分别依次于pH4.0和pH4.9进行等电点沉淀以除去杂蛋白，离心、取上清液。

⑨盐析调上清液pH为4.0，加饱和硫酸铵溶液至浓度为1.25mol／L盐析，离心，得沉淀物。

⑩除盐将沉淀物溶于少量蒸馏水中，对含0.1mol／L氯化钠的Tris-HCL（pH8.5）缓冲溶液进行透析，得透析内液。

⑩凝胶过滤透析内液上SephadesG-75凝胶柱，用含0.1mol／L氯化钠的50mmol／LTris-HCL（pH8.5）缓冲溶液进行洗脱，分步收集，活性GH存在于第Ⅱ峰中。

⑩透析将活性峰部分对6.5mmol／L的硼砂-盐酸（pH8.7）缓冲溶液进行透析，得透析内液。

⑩层析将透析内液上DEAE-C（DE-52）柱，用含0～0.3mol／L氯化钠的6.5mmol／L硼砂-盐酸（pH8.0）缓冲溶液进行梯度洗脱，合并活性峰，脱盐，冻干得GH。

2．人生长素的基因工程法

hGH的种属特异性很强，动物生长激素不能用于人，所以开始时hGH的惟一来源是从人尸体的脑垂体中取得，来源困难，价格昂贵，应用受到限制。

目前已利用基因工程技术生产出hGH，美国的Genentech公司利用枯草杆菌系统表达的hGH产量高达1.5g/L，这也是第一代重组人生长激素，商品名称为Protropin.

生产路线如图11-2所示。

（1）工艺过程如下：

工程菌的构建　利用基因工程技术构建高效分泌型基因工程菌株，在生长激素的N-端增加分泌信号肽序列，使表达合成的重组人生长激素结构和天然人生长激素完全一致。

菌种繁殖　采用M9培养基，添加CAA（酪蛋白氨基酸），调节pH至7．0，置于摇床上，30℃，进行菌种培养繁殖。

发酵培养基同菌种繁殖培养基，种子培养过夜，开始进行发酵，时间一般为16~18h，温度为37℃，pH7.0~7.5，溶解氧不能低于20%。

补料发酵在发酵进行5~7h后，需要适量补充葡萄糖、酵母浸出物、氮源、CAA、无机盐和微量无素，如PO43-、Fe2-、Co2-等离子，通过添加补料，可使菌体生长的对数期延，发酵菌体产量增加了一倍。

其余的发酵条件与上述条件相同，菌体生长至稳定期放罐。

。

离心　将发酵菌体进行冻融破碎，按一定比例，加入预冷的由10mmol/LTris和1mmol/LEDTA组成的缓冲溶液（pH7.5），80rpm搅拌1h，离心，收集上清液。

粗提在上清液中加入硫酸铵至饱和浓度45%，4℃放置2h，10000rpm离心30min，收集沉淀。

脱盐　沉淀用10mmol/LTris和1mmol/LEDTA组成的pH值为8.0的缓冲溶液溶解，用Sephadex-G25脱盐。

纯化　采用Phenyl-Sepharose，DEAE-Sepharose进行色谱，再加入固体硫酸铵达到饱和浓度45%，沉淀2h，离心，收集沉淀，溶解沉淀，再通过sephacrylS-11HR及DEAE-Sepharose进行纯化，得到人生长激素原料药半成品.。

（2）质量检验：

质量必须符合<

中华人民共和国药典>

2005年版二部附录规定。

目前，人和动物生长素基因都已在大肠杆菌中表达成功，重组人生长激素将会得到大规模的生产，从而造福人类。

（二）胰岛素（insulin）

胰岛素是胰脏中胰岛β细胞分泌的一种蛋白质激素，它是促进合成代谢的激素，在调节机体糖代谢、脂肪代谢、核蛋白质代谢方面都有重要作用，是维持血糖在正常水平的主要激素之一。

广泛存在于人和动物的胰脏中，正常人的胰脏约含有200万个胰岛，占胰脏总质量的1.5％。

胰岛由α、β和δ三种细胞组成，其中α细胞制造胰高血糖素和胰抗脂肝素，β细胞制造胰岛素，δ细胞制造生长激素抑制因子。

胰岛素在β细胞中开始时是以活性很弱的前体胰岛素原存在，进而分解为胰岛素进入血液循环，能使血糖降低，起到调节血糖作用。

临床上主要用于治疗胰岛素依赖性糖尿病及糖尿病昏迷和酮症酸中毒、精神分裂症、休克等。

胰岛素由A、B两条链组成，A链含21个氨基酸残基，B链含30个氨基酸残基，两链之间由两个二硫键相连，在A链内部含有一个二硫键。

不同种属动物的胰岛素分子结构大致相同，主要差别在A链二硫桥中间的第8位、9位和10位上的三个氨基酸及B链C末端的一个氨基酸上，随种属而异，但其生理功能是相同的。

生产胰岛素的方法较多，有传统的方法和基因工程技术方法。

1．动物胰脏制胰岛素

由动物胰脏生产胰岛素的方法较多，目前被普遍采用的是酸醇法和锌沉淀法。

现以酸醇法为例，介绍胰岛素的生产工艺。

其工艺路线如图11-3所示。

提取冻胰块用刨胰机刨碎，加入2.3～2.6倍的86％～88％乙醇（质量分数）和5％草酸，在12±

2℃搅拌提取3h，离心。

滤渣再用1倍量68％～70％乙醇和0.4％草酸提取2h，离心，合并乙醇提取液。

沉淀用于回收胰岛素。

碱化、酸化边搅拌提取液边加入浓氨水调pH8.0～8.4（12±

2℃），立即过滤，除去碱性蛋白，滤液应澄清，并及时用硫酸酸化至pH3.6～3.8，降温至5℃，静置4h以上，使酸性蛋白充分沉淀。

减压浓缩吸取上清液至减压浓缩锅内，下层用帆布过滤，沉淀物弃去，取上清液，30℃以下减压蒸去乙醇，浓缩至浓缩液相对密度为1.04～1.06（约为原体积的1／10～1／9为止）。

去脂、盐析浓缩液转入去脂锅内，5min内加热至50℃后，立即用冰盐水降温至5℃，静置3～4h，分离下层清液（脂层用于回收胰岛素）。

用盐酸调pH2.3～2.5，于22±

2℃搅拌加入27％（质量体积分数）固体氯化钠，保温静置数小时。

析出物即为胰岛素粗品。

精制盐析物按干重计算，加入7倍量蒸馏水溶解，再加入3倍量的冷丙酮，用4mol／L氨水调pH4.2～4.3，然后补加丙酮，使溶液中水和丙酮的比例为7∶3。

充分搅拌后，低温5℃以下放置过夜，次日在低温下离心分离，取上清夜，在上清夜中加入4mol／L氨水使pH6.2～6.4，加入3.6％（体积分数）的醋酸锌溶液（浓度为20％），再用4mol／L氨水调节pH6.0，低温放置过夜，次日过滤，分离沉淀。

结晶将沉淀用冷丙酮洗涤，得干品，再按干品质量每克加冷2％柠檬酸50mL、6.5％醋酸锌溶液2mL、丙酮16mL，并用冰水稀释至100mL，使其充分溶解，5℃以下，用4mol／L氨水调pH8.0，迅速过滤。

滤液立即用10％柠檬酸溶液调pH6.0，补加丙酮，使整个溶液体系保持丙酮含量为16％。

慢速搅拌3～5h使结晶析出。

在显微镜下观察，外形为正方形或扁斜形六面体结晶，再转入5℃左右低温室放置3～4d，使结晶完全。

离心收集结晶，并小心刷去上层灰黄色无定形沉淀，用蒸馏水或醋酸铵缓冲液洗涤，再用丙酮、乙醚脱水，离心后，在五氧化二磷真空干燥箱中干燥，即得结晶胰岛素。

（2）质量检验测定胰岛素效价，各国药典规定有家兔血糖降低法和小鼠血糖降低法。

（3）在整个生产过程中，为提高胰岛素的质量和产量，应注意以下几个方面：

胰脏质量是胰岛素生产中的关键，在我国是一个薄弱环节。

工业生产用的原料主要是猪、牛的胰脏。

不同种类和年龄的动物，其胰脏中胰岛素量有所差别，牛胰含量一般高于猪胰。

采摘胰脏要注意保持腺体组织的完整，避免摘断，并且离体后要立即深冻，先在-30℃以下急冻后转入-20℃保存备用，如用液氮速冻，效果更好。

在胰脏中，胰尾部分胰岛素含量较高，如单独使用可提高收率10％。

浓缩浓缩工序的条件，对胰岛素收率影响很大。

如采用离心薄膜蒸发器，在第一次浓缩后，浓缩液用有机溶剂去脂，再进行第二次浓缩，被浓缩溶液受热时间极短，避免了胰岛素效价的损失。

产品纯度在常规的结晶胰岛素中，除了胰岛素主成分外，还含有其他一些杂蛋白抗原成份，如胰岛素原、精氨酸胰岛素、胰多肽等。

因此要对结晶胰岛素进一步纯化，胰岛素原的含量显著降低。

2．人胰岛素的制备

（1）酶促半合成法

猪与人的胰岛素差别仅是B30位上的一个氨基酸，猪的是丙氨酸，人的则是苏氨酸。

利用胰蛋白酶的转酰胺作用，将猪胰岛素转化为人胰岛素B30苏氨酸（丁酰基）丁酸，通过硅胶柱层析，然后用三氟乙酸处理，断裂保护基团，再用离子交换层析纯化，得到高纯度人胰岛素。

（2）利用基因工程技术制备

目前，国际上生产医用重组人胰岛素（recombinanthumaninsulin,rhI）的方法主要有3种:

1）用基因工程大肠杆菌（Escherichiacoli,E.coli）分别发酵生产人胰岛素（humaninsulin,hI）的A、B链。

然后经化学再氧化法,使两条链在一定条件下重新形成二硫键,得到hI。

这一方法缺点较多,目前已较少使用。

2）用基因工程E.coli发酵生产人胰岛素原（humanproinsulin,hPI）,后经加工形成hI。

这种方法，E.c