生物技术实验Word格式.docx

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实验11、外源基因在大肠杆菌中的表达

实验12、目标蛋白的PAGE检测

实验13、RNA的提取及其纯度检测

实验14、逆转录PCR（RT-PCR）扩增基因特异片段

（一）实验目的

通过实验掌握从动物组织中提取DNA的基本原理和基本方法。

（二）实验原理

在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K笑话细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动物基因组DNA，用此法得到的DNA长度为100-150kb，适用于噬菌体构建基因组文库和DNA印迹分析。

（三）试剂、材料、仪器与器材

1.试剂与材料

1）Tris–HCL1mol/LPH8.050ml

配制方法：

40ml双蒸水，6.057g固体Tris放入烧杯中溶解，用浓盐酸调PH值到8.0，转移到50ml容量瓶中，加入双蒸水定容，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

2）生理盐水:

0.85%NaCL100ml

在20ml双蒸水中溶解0.85g固体NaCL，加水定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

3）EDTA0.5mol/LPH8.050ml

将9.08g的EDTA·

Na2·

2H2O溶解于40ml双蒸水，用1g的NaOH颗粒（慢慢逐步加入）调PH值到8.0，用50ml容量瓶定容，如果EDTA难溶，先加NaOH溶解，然后逐步加EDTA·

2H2O。

4）TES缓冲液（释放DNA）100ml

将0.5844g的5mol/lNaCl溶解于80ml双蒸水，在分别加入1ml的0.5mol/lEDTA、0.2ml的Tris-HCl（pH=8.0），加定容至100ml,摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

5）10%SDS（变性剂破细胞壁）100ml

将10g的十二烷基硫酸钠（SDS）溶解于80ml双蒸水于68℃加热溶解，用浓HCl调至PH=7.2，定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，4℃保存备用。

6）蛋白酶K（降解蛋白质）：

20mg/mL无菌三蒸水溶解。

7）RNA酶（降解RNA）（选配）

将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/L的Tris·

CL（PH7.5）、15mmol/LNaCL中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份存于–20℃。

8）氯仿：

异戊醇=24：

1100ml

按24:

1的比例加入氯仿、异戊醇，摇匀，转到准备好的瓶中，贴上标签，4℃保存备用。

9）TE缓冲液（溶解DNA）PH8.050ml

将0.5ml的10mmolTris-HCl（PH8.0）、0.1ml的0.5mol/lEDTA（PH8.0）加入到50ml的容量瓶中，调PH8.0定容至50ml摇匀后，转到准备好的瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

2.仪器与器材

移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、恒温水浴箱。

（四）操作步骤

1.组织块解冻，取适量组织于PBS溶液中清洗干净后放入装有500微升PBS的离心管中（1.5ml），用剪刀剪碎；

12000rpm离心8min，取出弃上清；

2.加入0.45mlTES混匀，再加入50ulSDS（10%），20ul蛋白酶K（20mg/ml），充分混匀后，于56℃保温4-6h，每2h摇1次,至体系透亮为好。

3.放置到室温，加入等体积饱和酚（500ul），上下温柔翻转5min,12000r/m，离心10min，分离水相和有机相，小心吸取上层含核酸的水相，到一个新的1.5ml离心管。

4.加入等体积酚：

氯仿：

异戊醇（25：

24：

1），上下温柔翻转5min，12000r/m，离心10分钟，取上层转移到新的1.5ml离心管中。

5.加入等体积氯仿：

异戊醇（24：

1），上下温柔翻转5min，10000r/m，离心10分钟，取上层清液到一个新的1.5ml离心管。

6.加入1/10体积的NaAc（4℃保存），加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇沉淀DNA，置于-20℃中保存30min或更久；

观察现象。

7.12000r/m，离心10分钟，弃乙醇。

8.-20℃保存的75%乙醇洗涤，12000r/m，离心5分钟，去乙醇，55℃干燥DNA。

9.加入适量TE溶解DNA（具体依DNA的多少而定）（一般50μL），-20℃保存备用。

如果除去其中的RNA，可加5μlRNaseA（10μg/μl）,37℃保温30min，用苯酚抽提后，按步骤9和10重沉淀DNA。

（五）注意事项

1.要充分除去DNA提取液中的苯酚，否则会影响以后的操作。

2.用酚-氯仿-异戊醇（体积比为25：

1）抽提后取上清是不能将中间的蛋白质扰动，以防蛋白质污染。

3.酚-氯仿-异戊醇中的异戊醇是用来消除实验中可能产生的泡沫。

4.抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切力对DNA的损伤。

5.取上层清液时，注意不要吸起中间的蛋白质层。

6.乙醇漂洗去乙醇时，不要荡起DNA。

7.离心后，不要晃动离心管，拿管要稳，斜面朝外。

（六）思考题

1.操作4中的蛋白酶K有什么作用？

2.操作7中的乙醚有什么作用？

3.如何除去DNA提取物中的RNA？

学习PCR体外扩增的原理及其引物设计原则；

了解扩增过程中各因素对扩增结果的影响；

掌握PCR的基本操作。

（二）实验原理

PCR（polymerasechainreaction）是在体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应。

在分子生物学研究中，广泛地应用于研究基因突变，获取加上酶切位点的目的基因和DNA序列测定等方面，是分子生物学中一项极为常用的技术。

PCR的原理是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。

两个引物分别位于靶序列的两端，同两条模板的3＇端互补，由此限定扩增片段。

PCR反应由一系列的变性——退火——延伸反复循环构成，即在高温下模板双链DNA变性解链，然后在较低的温度下同过量的引物退火，再在适中的温度下由DNA聚合酶催化进行延伸。

由于每一循环的产物都可作为下一循环反应的模板，因此扩增产物的量以指数级方式增加。

理论上，经过n次循环可使特定片段扩增到2n-1，考虑到扩增效率不可能达到100％，实际上要少些，通常经25～30次循环可扩增106倍，这个量足够分子生物学研究的一般要求。

1PCR引物设计

（1）Tm值Tm值是PCR引物设计中的一个重要参数，是指引物与模板之间精确互补并且在模板过量的情况下有50％的引物与模板配对，而另外50％的引物处于解离状态时的温度，Tm值一般高于55℃。

合适的引物选择应需考虑到以下因素，如Taq酶的最适温度（TE）和Tm值等。

最常用的Taq酶的最适温度（TE）范围为70～74℃，根据TE可以先确定一个合适的退火温度范围（Ta）。

这个温度范围应不高于酶的最适反应温度，也不能比TE－25℃更低。

这是因为如果退火温度低于酶的最适反应温度时，酶的合成反应会非常缓慢，但片面考虑提高温度又会造成引物脱落而不能进行PCR扩增。

所以Ta的选择应满足TE-25℃<

Ta<

TE。

（2）引物的长度引物长度一般在15～30个核苷酸之间比较合适。

引物过短时造成Tm值过低，不能与模板很好地配对或是配对专一性很低。

引物过长时又会造成Tm值过高，超过酶的最适反应温度，还使合成引物的费用大大增加。

当然若要在引物的5＇末端加上特定的酶切位点等碱基则可稍长。

（3）引物的GC％含量引物的GC比最好设计在40％～60％的范围内。

GC比过高与过低都会直接造成Tm值的过高与过低。

如上所述，Tm值的估计可简单地根据经验式Tm＝4×

GC+2×

AT+3.3℃获得。

（4）引物3′端起始碱基Taq酶在3′末端错配时延伸效率是不一样的，延伸效率为T>

G＝C>

A。

即当引物3′末端为A时，即使有错配碱基也最不易延伸，所以引物设计时可将3′末端设计为A，以提高复制精确性。

另一种理论是3′末端应设计为G或C，因为G和C的氢键多于A与T，能更好地与模板结合开始DNA合成，当然对错配延伸效率方面就不能苛求了。

总而言之，引物的3′末端不要考虑使用T。

（5）引物无发卡结构引物自身应无发卡结构。

（6）二引物自身之间不能配对二引物自身不能配对是指同一对引物之间不能有配对的多个碱基，特别是在引物的3′末端。

二引物间不能配对的道理与二引物本身不能配对相同，若发生这种情况会形成引物二聚体，造成扩增失败。

一般引物自身配对形成茎环结构，茎的碱基对数不大于3，两条引物间配对碱基数小于5个。

（7）二引物的Tm值引物设计时应注意使二引物的Tm值相近，否则二个引物必然不能同时达到最佳退火温度，将会影响PCR扩增效果。

能同时达到最佳退火温度，将会影响PCR扩增效果。

由于影响引物设计的因素比较多，所以常利用计算机来辅助设计，通常可用primer5.0软件或其它PCR引物设计程序来帮助设计。

2PCR反应条件

1．PCR缓冲液常用的1×

PCR缓冲液为10mmol／LTris-HClpH8.3（常温），50mmol／LKCl，1.5mmol／LMgCl2。

由试剂公司与Taq酶一起提供。

（1）Mg2+离子浓度：

Mg2+离子浓度对PCR反应影响很大，因为[Mg2+]与引物-模板及产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的生成、产物的忠实性、酶活力、产物的产量等诸多因素有关。

Mg2+一般使用浓度为0.5～2.5mmol／L，必要时可以0.5mmol／L梯度间隔做Mg2+最适浓度试验。

（2）dNTP：

常用dNTP浓度为20μmol／L（可用范围为20～200μmol／L）。

dNTP的用量与PCR产量及产物忠实性有关，dNTP量过少时合成的产物减少。

可以被Taq酶接受的经过修饰的dNTP有以下几类：

dig-11dUTP、5—bromo-dUTP、biotin-11—dUTP、biotin-16—dUTP、7—deaza-dGTP和次黄嘌呤。

但不是所有的聚合酶都能接受经过修饰的dNTP。

（3）K+离子浓度：

PCR反应中K+离子的作用是促进Taq酶活力与促进引物退火，一般使用浓度是50mmol／L，但当K+离子浓度高于50mmol／L时会抑制Taq酶活力。

（4）pH值：

PCR反应中用的是Tris-HCL缓冲系统。

Tris-HCL缓冲系统的特点是具有很高的温度系数（0.021pH／℃），20℃时pH为8.3的缓冲液在72℃延伸反应时，实际pH值降低至7.2。

而Tricine的温度系数较高，在扩增长片段时用Tricine系统。

（5）保护剂：

由于PCR反应体系中蛋白的含量极低，所以加入的酶非常容易变性，通常需加入一定量的保护剂。

如5mmol／L的二硫苏糖醇（DTT），100μg／ml的小牛血清白蛋白（BSA）或0.01％的明胶。

加入保护剂对PCR循环数较多的扩增反应效果尤其明显。

2．模板PCR模板可以是DNA