生物技术实验Word格式.docx

1、实验11、外源基因在大肠杆菌中的表达实验12、目标蛋白的PAGE检测实验13、RNA的提取及其纯度检测实验14、逆转录PCR（RT-PCR）扩增基因特异片段（一）实验目的通过实验掌握从动物组织中提取DNA的基本原理和基本方法。（二） 实验原理在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K笑话细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动物基因组DNA，用此法得到的DNA长度为100-150kb，适用于噬菌体构建基因组文库和DNA印迹分析。（三）试剂、材料、仪器与器材1. 试剂与材料1） TrisHCL 1mol/L PH8.0 50ml配制方法：40ml双蒸水，6.057g固体Tris放入烧杯中溶解，用浓盐

2、酸调PH值到8.0，转移到50ml容量瓶中，加入双蒸水定容，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4保存备用。2） 生理盐水: 0.85%NaCL 100ml在20ml双蒸水中溶解0.85g固体NaCL，加水定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4保存备用。3） EDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml将9.08g的EDTANa22H2O溶解于40ml双蒸水，用1g的NaOH颗粒（慢慢逐步加入）调PH值到8.0，用50ml容量瓶定容，如果EDTA难溶，先加NaOH溶解，然后逐步加EDTA2H2O。4） TES缓冲液（释放

3、DNA） 100ml将0.5844g的5 mol/lNaCl溶解于80ml双蒸水，在分别加入1ml的0.5 mol/l EDTA、0.2ml的Tris-HCl （pH=8.0），加定容至100ml, 摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4保存备用。5） 10% SDS（变性剂 破细胞壁）100ml将10g的十二烷基硫酸钠（SDS）溶解于80ml双蒸水于68加热溶解，用浓HCl调至PH=7.2，定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，4保存备用。6） 蛋白酶K（降解蛋白质）：20mg/mL 无菌三蒸水溶解。7） RNA酶 （降解RNA）（选配）将胰RN

4、A酶（RNA酶A）溶于10mmol/L的TrisCL（PH7.5）、15mmol/LNaCL中，配成10mg/ml的浓度，于100加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份存于20。8） 氯仿：异戊醇=24：1 100ml按24:1的比例加入氯仿、异戊醇，摇匀，转到准备好的瓶中，贴上标签，4保存备用。9） TE缓冲液（溶解DNA） PH8.0 50ml将0.5ml 的10mmol Tris-HCl（PH8.0） 、0.1ml的0.5mol/l EDTA（PH8.0） 加入到50ml的容量瓶中，调PH8.0定容至50ml摇匀后，转到准备好的瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4保存备用。2.

5、仪器与器材移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、恒温水浴箱。（四）操作步骤1. 组织块解冻，取适量组织于PBS溶液中清洗干净后放入装有500微升PBS的离心管中（1.5ml），用剪刀剪碎；12000rpm离心8min，取出弃上清；2. 加入0.45ml TES混匀，再加入50ul SDS（10%），20ul蛋白酶K（20mg/ml），充分混匀后，于56保温4-6h，每2h摇1次,至体系透亮为好。3. 放置到室温，加入等体积饱和酚（500ul），上下温柔翻转5min,12000r/m，离心10min，分离水相和有机相，小心吸取上层含核酸的水相，到一个新的1.5ml离心管。4. 加入等体积酚：氯仿：

6、异戊醇（25：24：1），上下温柔翻转5min，12000r/m，离心10分钟，取上层转移到新的1.5ml离心管中。5. 加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），上下温柔翻转5min，10000r/m，离心10分钟，取上层清液到一个新的1.5ml离心管。6. 加入1/10体积的NaAc（4保存），加入2倍体积的-20预冷的无水乙醇沉淀DNA，置于-20中保存30min或更久；观察现象。7. 12000 r/m，离心10分钟，弃乙醇。8. -20保存的75%乙醇洗涤，12000 r/m，离心5分钟，去乙醇，55干燥DNA。9. 加入适量TE溶解DNA（具体依DNA的多少而定）（一般50L），-20保

7、存备用。如果除去其中的RNA，可加5l RNaseA（10g/l）,37保温30min，用苯酚抽提后，按步骤9和10重沉淀DNA。（五）注意事项1. 要充分除去DNA提取液中的苯酚，否则会影响以后的操作。2. 用酚-氯仿-异戊醇（体积比为25：1）抽提后取上清是不能将中间的蛋白质扰动，以防蛋白质污染。3. 酚-氯仿-异戊醇中的异戊醇是用来消除实验中可能产生的泡沫。4. 抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切力对DNA的损伤。5. 取上层清液时，注意不要吸起中间的蛋白质层。6. 乙醇漂洗去乙醇时，不要荡起DNA。7. 离心后，不要晃动离心管，拿管要稳，斜面朝外。（六）思考题1. 操作4中的蛋白酶K有

8、什么作用？2. 操作7中的乙醚有什么作用？3. 如何除去DNA提取物中的RNA？ 学习PCR体外扩增的原理及其引物设计原则；了解扩增过程中各因素对扩增结果的影响；掌握PCR的基本操作。（二）实验原理 PCR（polymerase chain reaction）是在体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应。在分子生物学研究中，广泛地应用于研究基因突变，获取加上酶切位点的目的基因和DNA序列测定等方面，是分子生物学中一项极为常用的技术。 PCR的原理是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。两个引物分别位于靶序列的两端，同两条模板的3端

9、互补，由此限定扩增片段。PCR反应由一系列的变性退火延伸反复循环构成，即在高温下模板双链DNA变性解链，然后在较低的温度下同过量的引物退火，再在适中的温度下由DNA聚合酶催化进行延伸。由于每一循环的产物都可作为下一循环反应的模板，因此扩增产物的量以指数级方式增加。理论上，经过n次循环可使特定片段扩增到2n-1，考虑到扩增效率不可能达到100，实际上要少些，通常经2530次循环可扩增106倍，这个量足够分子生物学研究的一般要求。1 PCR引物设计（1） Tm值 Tm值是PCR引物设计中的一个重要参数，是指引物与模板之间精确互补并且在模板过量的情况下有50的引物与模板配对，而另外50的引物处于解离

10、状态时的温度，Tm值一般高于55。合适的引物选择应需考虑到以下因素，如Taq酶的最适温度（TE）和Tm值等。最常用的Taq酶的最适温度（TE）范围为7074，根据TE可以先确定一个合适的退火温度范围（Ta）。这个温度范围应不高于酶的最适反应温度，也不能比TE25更低。这是因为如果退火温度低于酶的最适反应温度时，酶的合成反应会非常缓慢，但片面考虑提高温度又会造成引物脱落而不能进行PCR扩增。所以Ta的选择应满足TE-25TaGCA。即当引物3末端为A时，即使有错配碱基也最不易延伸，所以引物设计时可将3末端设计为A，以提高复制精确性。另一种理论是3末端应设计为G或C，因为G和C的氢键多于A与T，能

11、更好地与模板结合开始DNA合成，当然对错配延伸效率方面就不能苛求了。总而言之，引物的3末端不要考虑使用T。（5）引物无发卡结构 引物自身应无发卡结构。（6）二引物自身之间不能配对 二引物自身不能配对是指同一对引物之间不能有配对的多个碱基，特别是在引物的3末端。二引物间不能配对的道理与二引物本身不能配对相同，若发生这种情况会形成引物二聚体，造成扩增失败。一般引物自身配对形成茎环结构，茎的碱基对数不大于3，两条引物间配对碱基数小于5个。（7）二引物的Tm值 引物设计时应注意使二引物的Tm值相近，否则二个引物必然不能同时达到最佳退火温度，将会影响PCR扩增效果。能同时达到最佳退火温度，将会影响PCR

12、扩增效果。由于影响引物设计的因素比较多，所以常利用计算机来辅助设计，通常可用primer 5.0软件或其它PCR引物设计程序来帮助设计。2 PCR反应条件1PCR缓冲液 常用的1PCR缓冲液为10mmolL Tris-HCl pH8.3（常温），50mmolL KCl，1.5mmolL MgCl2。由试剂公司与Taq酶一起提供。（1）Mg2+离子浓度：Mg2+离子浓度对PCR反应影响很大，因为Mg2+与引物-模板及产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的生成、产物的忠实性、酶活力、产物的产量等诸多因素有关。Mg2+一般使用浓度为0.52.5mmolL，必要时可以0.5mmolL梯度间隔做Mg

13、2+最适浓度试验。（2）dNTP：常用dNTP浓度为20molL（可用范围为20200molL）。dNTP的用量与PCR产量及产物忠实性有关，dNTP量过少时合成的产物减少。可以被Taq酶接受的经过修饰的dNTP有以下几类：dig-11dUTP、5bromo-dUTP、biotin-11dUTP、biotin-16dUTP、7deaza-dGTP和次黄嘌呤。但不是所有的聚合酶都能接受经过修饰的dNTP。（3）K+离子浓度：PCR反应中K+离子的作用是促进Taq酶活力与促进引物退火，一般使用浓度是50mmolL，但当K+离子浓度高于50mmolL时会抑制Taq酶活力。（4）pH值：PCR反应中用的是Tris-HCL缓冲系统。Tris-HCL缓冲系统的特点是具有很高的温度系数（0.021pH），20时pH为8.3的缓冲液在72延伸反应时，实际pH值降低至7.2。而Tricine的温度系数较高，在扩增长片段时用Tricine系统。（5）保护剂：由于PCR反应体系中蛋白的含量极低，所以加入的酶非常容易变性，通常需加入一定量的保护剂。如5mmolL的二硫苏糖醇（DTT），100gml的小牛血清白蛋白（BSA）或0.01的明胶。加入保护剂对PCR循环数较多的扩增反应效果尤其明显。2模板 PCR模板可以是DNA