干旱胁迫对小麦幼苗生理生化指标的影响Word文件下载.docx

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世界上约有70%的小麦播种面积分布在干旱、半干旱农业区，干旱对小麦的生理、生化都产生重要的影响，进而影响小麦的生长发育、产量和品质。

因此，为了减小环境对小麦生产的影响，有必要从小麦的各项生理生化指标含量的变化，来研究干旱胁迫对小麦的影响。

本次实验是研究吸胀12小时萌发一周后，干旱处理一周的小麦其生理生化指标脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）、抗氧化酶（PPO、POD）、谷胱甘肽（GSH）、抗坏血酸（ASA）含量的变化。

一、材料与方法

1、材料及处理

将吸胀12小时的小麦种子在有6层湿润滤纸的带盖白磁盘（24cmX16cm）培养基中生长7天，7天后将其中一部分幼苗干旱生长7天，7天后用相同的方法分别对实验组和对照组的小麦进行脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）、抗氧化酶（PPO、POD）、谷胱甘肽（GSH）、抗坏血酸（ASA）的含量的测定。

2、测定方法[1]

（1）小麦种子发芽率的测定

各取50粒吸胀的小麦种子→沿胚的中心线切成两半（严格区分两个半粒），进行下列实验：

其中50个半粒进行TTC染色（30℃水浴20min），另50个半粒进行曙红染色（室温染色10min）根据两种方法的染色情况，分别计算发芽率。

（2）脯氨酸（Pro）含量的测定

①脯氨酸（Pro）的提取：

分别取0.1g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3mL3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂→充分研磨→用2mL3%SSA洗研钵→5000rpm离心10min→上清液定容至5mL。

②脯氨酸（Pro）的测定：

上清液各2mL→分别加入2mL冰乙酸和2mL茚三酮试剂→煮沸15min→冷却后→5000rpm离心10min（若没沉淀可略此步骤）→分别测定A520,

将测得的结果用公式

Procontent=

计算出正常和干旱生长小麦的胚芽鞘的脯氨酸含量。

（3）丙二醛（MDA）含量的测定

①丙二醛（MDA）的提取：

分别取0.1g实验组和对照组→加入3mL10%TCA和少许石英砂→充分研磨→用2mL10%TCA洗研钵→5000rpm离心10min→上清液定容至5mL。

②丙二醛（MDA）的测定：

分别取上清液各2mL→加入0.6%TBA（用10%TCA配制）2mL→煮沸12min→冷却后→5000rpm离心5min→分别测定OD450和OD532

将测得的OD450和OD532的数据带入下列公式

OD450=C1x85.4

OD532=C1x7.4+C2X155000

C1：

可溶性糖的浓度，C2：

MDA的浓度

解方程计算出C1可溶性糖的浓度，C2MDA的浓度。

（4）过氧化氢（H2O2）含量的测定

①过氧化氢（H2O2）的提取：

分别取0.1g实验组和对照组→加入3mL50mMPBS（pH=6.8，内含1mMHA）和少许石英砂→充分研磨→用2mLPBS洗研钵→5000rpm离心10min→上清液定容至5mL。

②过氧化氢（H2O2）含量的测定：

分别取上清液各3mL→加入0.1%Ti（SO4）2[用20%（v/v）H2SO4配制]1mL→摇匀→5000rpm离心10min→OD410

将测得的OD410值带入下列公式

H2O2content=

（?

mmol.g-1FW）计算出H2O2酶的含量。

（5）抗氧化酶（PPO、POD）的测定

①抗氧化酶（PPO、POD）的提取：

分别取0.1g实验材料→加入少许石英砂和3ml提取液（50mmol/LPBS,pH6.0,内含0.１mmol/LEDTA,1%PVP）→充分研磨　→转入离心管中→用2ml提取液洗研钵→5000rpm离心10min→上清液定容至5ml→用于测定POD和PPO酶活性或分装后转至-20或-80℃保存。

②POD测定：

取POD反应混合液（10　mmol/L愈创木酚，5mmol/LH2O2,用PBS溶解）2.95ml，加入酶液50ul（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应2min时的A470。

③PPO测定：

取PPO反应混合液（20mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）2.9ml，加入酶液0.1ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应2min时的A410。

将测得的A470和A410数据带入公式

PODactivities=

（umol.g-1FW）

PPOactivies=

（U.g-1FW）

计算出PPO和POD的值

（6）谷胱甘肽（GSH）含量的测定

①谷胱甘肽（GSH）的提取：

分别取0.1g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3mL5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂→充分研磨→用2mL5%TCA洗研钵→5000rpm离心10min→上清液定容至5mL。

②谷胱甘肽（GSH）含量的测定：

上清液各1mL→分别加入2mL0.1MPBS（pH=7.7）→1mL2mMDTNB→25℃5min→测定A412

将测得的A412值带入公式

GSHcontent=

（umol.g-1FW）将GSH的值计算出来

（7）、ASA含量的测定

①ASA的提取：

分别取0.1g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3ml5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂→充分研磨→用2ml5%三氯乙酸（TCA）洗研钵→5000rpm离心10min→上清液定容至5ml

②ASA的测定：

上清液各0.8ml（空白用5%TCA代替）→→摇匀→分别加入0.8ml5%TCA、44%磷酸和4%联吡啶→摇匀→加入3%FeCl30.8ml→37℃15min→测定A525

将测得的A525值带入公式

GSHcontent=

（umol.g-1FW）将ASA的值计算出来

二、实验结果

1、小麦发芽率的结果

两种方法测得的小麦发芽率不同，TTC法测得的小麦种子成活26粒，发芽率为52%，而署红法测得的小麦种子成活47粒，发芽率为94%。

产生这种现象的原因是我们当时在做实验时不知道胚的具体位置，导致在切的时候没有沿胚切成两半，所以染色的结果刚开始是错误的。

后面我们问了老师胚的位置，所以用署红法测得的结果基本接近实际。

可能我们在数的时候有的因染色的部位少没有严格的区分导致结果没有达到100%。

但是从结果可以看出，小麦的发芽率还是很高的。

2、干旱胁迫对小麦胚芽鞘脯氨酸（Pro）含量的影响和分析

实验测得：

正常生长OD=0.006

干旱生长OD=1.858

从图中可以看出，小麦在干旱胁迫下时的脯氨酸的含量很高，

为正常植株中的脯氨酸含量的262倍，这说明正常情况下小麦胚芽鞘内脯氨酸含量较低，但当遇到干旱胁迫时小麦胚芽鞘内的含量可以增加数十倍甚至几百倍。

这一结果与山东农业科学洪法水李樊和在研究自然干旱胁迫下小麦品种游离脯氨酸与抗旱性的关系所得到的结果一致[2]。

3、干旱胁迫对小麦胚芽鞘丙二醛（MDA）含量影响

正常生长OD450=0.045OD532=0.028

干旱生长OD450=0.401OD532=0.291

小麦

MDA含量

可溶性糖含量

正常生长

0.1554umol/L

0.52695umol/L

干旱生长

1.65239umol/L

4.69571umol/L

由表格可以看出干旱胁迫下生长的小麦胚芽鞘内所含的可溶性糖和MDA量比正常生长的小麦所含量高。

这一结果与山东农业大学研究生吴耀领再做抗旱性与丰产型小麦对干旱胁迫的响应所得到得结果一致[3]。

4、干旱胁迫对小麦胚芽鞘过氧化氢（H2O2）含量影响。

正常生长OD410=0.098

干旱生长OD410=0.414

从图中可以看出干旱情况下的含量为98.57umol.g-1FW,正常情况下的为23.33umol.g-1FW，可以看出来干旱下的含量是正常生长的4倍多，这一结果与高方胜所作的土壤水分对番茄植物体内过氧化氢酶含量的含量变化相符，在干旱胁迫下植物体内的氧化酶含量升高相一致[4]。

5、干旱胁迫对抗氧化酶（PPO、POD）含量的影响

POD正常生长A470=0.256

干旱生长A470=0.972

PPO正常生长A410=0.081

干旱生长A410=0.151

POD含量

PPO含量

正常生长

干旱生长

0.93

umol.g-1FWmin-1

0.24

130.17

69.83

结果表明，在干旱生长下的过氧化酶的含量比正常生长下要高很多，说明干旱胁迫下的POD和PPO活性比正常水平的POD和PPO活性强，从而在干旱生长时过氧化酶大量积累。

6、干旱胁迫对谷胱甘肽（GSH）含量的影响和分析

正常生长OD412=0.096

干旱生长OD412=0.183

从图中可以看出，实验组GSH含量2.69umol.g-1FW,对照组含量1.41umol.g-1FW，实验组和对照组的含量存在差异，实验组GSH含量远比对照组的高。

说明干旱胁迫使GSH含量升高。

7、干旱胁迫对抗坏血酸（ASA）含量的影响和分析

实验测得：

正常生长OD525=0.007

干旱生长OD525=0.021

从图中可以看出，干旱生长下抗坏血酸（ASA）的含量比正常生长下抗坏血酸的含量高很多，说明小麦在正常情况下ASA的含量很低，但是当遇到干旱胁迫时，植株的ASA大量积累。

三、结果分析与讨论

本实验表明:

在干旱胁迫下,小麦幼苗生长受到一定抑制作用,生理生化指标发生一系列变化,具体表现为：

小麦幼苗胚芽鞘中脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）、抗氧化酶（PPO、POD）、谷胱甘肽（GSH）、抗坏血酸（ASA）的含量在干旱胁迫下含量较正常情况下的明显升高。

1、干旱胁迫下脯氨酸（Pro）含量的变化：

干旱胁迫下脯氨酸增加的原因为:

①脯氨酸脱氢酶活性降低,使脯氨酸氧化减弱;

②干旱抑制了蛋白质的合成,脯氨酸的利用降低,使其在植物体内积累增加。

③脯氨酸的分解代谢开始于它的氧化分解，执行此功能的酶称为Pro脱氢酶（PDH），它以FAD为辅因子将Pro降解为P5C，后者在P5C还原酶（P5CR）的作用下又重新合成谷氨酸，完成Pro代谢的循环过程。

所以，在Pro的降解过程中PDH是Pro