分子生物学实验教学教案Word文档格式.docx

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实验类型

综合性

实验目的和要求：

通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。

实验设备及器材：

控温摇床（37℃），高速冷冻离心机，水浴锅，冰箱（-20℃,‐70℃）

超净工作台，培养箱（37℃），752分光光度计，灭菌锅等。

实验原理：

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。

转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导人细菌的过程。

其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。

转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。

将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过中获得的新的表型（如Ampr等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择培养基上。

实验内容：

将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。

将已经转化的细胞在选择培养基上进行筛选。

学生实验报告要求：

实验报告要求把每个实验步骤都进行分析。

注意事项：

无菌操作

低温操作

实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

实验目的通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。

实验原理将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。

转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（Rˉ,Mˉ）,它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。

为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：

1.细胞生长状态和密度:

细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。

DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×

107个ml左右（不同的菌株情况有所不同）,这时比较合适。

密度过高或不足均会影响转化效率。

2.质粒的质量和浓度:

1ng的cccDNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。

一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。

3.试剂的质量:

所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的（GR.或AR.）,并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。

4.防止杂菌和杂DNA的污染。

　　本实验以E.coliDH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pUC19质粒共保温,实现转化。

由于pUC19质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr），可通过Amp抗性来筛选转化子。

如受体细胞没有转入pUC19，则在含Amp的培养基上不能生长。

能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pUC19。

转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。

一.仪器控温摇床（37℃）高速冷冻离心机

水浴锅冰箱（-20℃,‐70℃）

超净工作台培养箱（37℃）

752分光光度计灭菌锅

二.试剂CaCl2无菌水,冰

胰蛋白胨酵母粉

AmpNaCl

三.其他用品

移液器，枪头

1.5ml,50ml离心管三角瓶500ml200ml

6cm平皿试剂瓶60ml

量筒烧杯

琼脂甘油

酒精灯三角玻棒

酒精棉球火柴

［溶液配制］0.1molLCaCl2溶液配置灭菌

LB液体培养基

氨苄青霉素（Amp），用无菌水配制成50_60mgmL溶液，抽虑灭菌置－20℃冰箱中保存。

四.材料E.coli.DH5α

质粒DNA

五:

实验步骤：

（CaCl2）（20人一班，分三组）

第一天：

从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于2mLLB液体培养基的试管中,37℃振荡培过夜。

第二天：

1.取0.5mL菌液转接到一个含有50mLLB液体培养基锥形瓶中，37℃振荡培养

2－3。

4.离心10min（4000rmin）,回收细胞。

4℃

5.倒出培养液，将管倒置1min以便培养液流尽。

6.用冰冷的0.1molLCaCl210mL悬浮沉淀，立即放在冰上30min。

7.0－4℃6000rmin,离心10min，回收细胞。

8.用冰冷的0.1molLCaCl22mL悬浮细胞，（务必放在冰上）。

9.分装细胞，每200μL一份。

此细胞为感受态细胞。

转化：

10.取200μL新鲜制备的感受态细胞，加入DNA2μL（50ng）混匀冰上放置30min。

同时作两个对照管

受体菌对照：

200μL感受态细胞＋2μL无菌水

质粒对照：

200μL0.1molLCaCl2溶液＋2μL质粒DNA溶液

11.将管放到42℃循环水浴1－2min。

12.冰浴2min。

1.13.每管加800μLLB液体培养基，37℃培养1离心2min。

2.弃上清，吸尽残液，使细胞沉淀尽可能干燥。

3.加入100ul溶液Ⅰ，充分混匀，室温放置10min。

加200ul溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管盖，轻轻颠倒数次混匀，将离心管放冰上5min。

4.加入150ul溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。

冰上放置15min。

5.12000rmin,离心15min，将上清转至另一离心管中。

6.加入等体积酚：

氯仿（1：

1）（去蛋白），反复混匀，12000rmin，离心5min，将上清转移到另一离心管中。

7.加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。

12000rmin离心5min。

倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

8.用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。

9.加50ulTE缓冲液，其中含有20ugml的胰RNA酶，使DNA完全溶解，－20℃保存。

（二）酶切

取DNA溶液，加酶切缓冲液，EcoRI酶1ul，无菌水补至总体积10ul，37℃保温3h,加终止液，准备下个实验电泳，分析质粒DNA的限制性酶切图谱。

质粒提取的关键问题即质粒提取中三种溶液的作用：

碱法质粒抽提用到三种溶液：

溶液I，50mM葡萄糖25mMTris-Cl10mMEDTA，pH8.0；

溶液II，0.2NNaOH1%SDS；

溶液III，3M醋酸钾2M醋酸。

让我们先来看看溶液I的作用。

任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。

那么50mM葡萄糖是干什么的呢？

说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。

因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。

所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。

那么EDTA呢？

大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：

抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。

在溶液I中加入高达10mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。

如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。

如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？

实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。

有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。

轮到溶液II了。

这是用新鲜的0.4N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。

要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。

很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。

事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。

用了不新鲜的0.4NNaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。

如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。

很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。

有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？

那是为下一步操作做的铺垫。

这一步要记住两点：

第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；

第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。

基因组DNA的断裂会带来麻烦。

每个人都知道，溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。

最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。

如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。

大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。

如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。

既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？

在1％的SDS溶液中慢慢加入5N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。

因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。

但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。

这其实是十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassiumdodecylsulfate,PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。

如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。

大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。

这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。

那么2M的醋酸又是为什么而加的呢？

是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。

基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。

所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。

很多人误认为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。

NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。

溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。

不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚氯仿异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长