系统性红斑狼疮患者Fas和CD40L表达的初步研究Word下载.docx
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作者：
徐红星,邱德华,王慧娟,杨晓帆,季晓辉【摘要】目的探讨系统性红斑狼疮（SLE）患者凋亡调节蛋白受体Fas及共刺激分子CD40L的表达情况及其相互之间的调节。
方法采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测SLE患者和正常人血清sFas和sCD40L的水平并分析两者之间的相关性;
同时分离10例SLE患者和10例正常对照的外周血淋巴细胞：
①将细胞培养48h后，采用流式细胞仪检测T细胞亚群表面Fas及CD40L的表达情况;
②在培养过程中分别加入抗FasL抗体阻断Fas信号及抗CD40L抗体阻断CD40L信号后，观察T细胞亚群表面CD40L及Fas的表达。
结果①SLE患者血清sFas和sCD40L平均水平分别为4.18μg/L和5.87μg/L，显著高于正常对照组2.27μg/L和2.31μg/L,且SLE患者血清sFas活动期高于稳定期（P0.01或P0.05）;
sFas、sCD40L水平与SLEDAI（疾病活动指数）之间存在一定的正相关性（r=0.688,r=0.253，P均0.05）,但sFas与sCD40L水平之间未显示明显相关（r=0.201，P0.05）。
②经细胞培养后，SLE患者CD4（+）和CD8（+）T细胞表面Fas表达增加，与正常对照组比较，差异有显著性（P0.01或P0.05）;
SLE患者CD4（+）和CD8（+）T细胞表面CD40L表达增加，与正常对照组比较，差异有显著性（P均0.05）。
③SLE患者CD4（+）及CD8（+）T细胞上Fas与CD40L表达均呈正相关关系（r=0.311和r=0.517，P均0.05）。
④加入抗FasL抗体阻断后，CD4（+）和CD8（+）T细胞表面CD40L表达下降，与阻断前比较，差异有显著性（P0.05）;
加入抗CD40L抗体阻断后，CD4（+）和CD8（+）T细胞表面Fas表达与阻断前比较差异无显著性（P0.05）。
结论SLE患者血清sFas和sCD40L水平升高且呈正相关关系;
T细胞亚群表面Fas及CD40L高表达且呈正相关关系;
T细胞上Fas的表达调控CD40L的表达。
说明凋亡调节蛋白Fas及共刺激分子CD40L可能共同参与SLE的发病过程。
【关键词】系统性红斑狼疮;
Fas;
CD40L Abstract:
ObjectiveToinvestigatetheexpressionsofFasandCD40Linpatientswithsystemiclupuserythematosus（SLE）.MethodsSerumsFas,sCD40LlevelsinpatientswithSLEandhealthycontrolsweredeterminedusingacommerciallyavailableELISAsystemandthecorrelationbetweenthelevelsofsFasandsCD40Lwasanalyzed.Meanwhile,peripheralbloodmononuclearcells（PBMC）ofpatientswithSLEandhealthcontrolswereisolatedbygradientcentrifugationofheparinizedblood.TheexpressionsofFasandCD40LonCD4（+）andCD8（+）TlymphocytesinpatientswithSLEandcontrolsweredeterminedbyflowcytometry（FCM）aftercultivationfor48h.TheantibodiesofFasLandCD40Lwereaddintheprocessofcultivation,andthentheexpressionsofCD40LandFasofperipheralbloodTlymphocytesweredetermined.Results①TheaveragelevelsofsFasandsCD40LinSLEpatientswere4.18μg/Land5.87μg/L,respectively,whichweremarkedlyhigherthanthoseof2.27μg/Land2.31μg/Linthehealthycontrols;
theserumlevelsofsFasandsCD40LweresignificantlyhigherinactiveSLEpatientsthanthoseinactivepatients（P0.01,P0.05）;
theserumlevelsofsFasandsCD40LwereshowntohaveapositivecorrelationwithSLEDAIscores（r=0.688,r=0.253,P0.05）,whilenopositivecorrelationwasrevealedbetweenthelevelsofsFasandsCD40L（r=0.201,P0.05）.②TheexpressionsofFasonCD4（+）andCD8（+）TlymphocytesinpatientswithSLEweresignificantlyhigherthanthoseofthehealthycontrols（P0.01andP0.05）;
theexpressionsofCD40LonCD4（+）andCD8（+）TlymphocytesinpatientswithSLEweresignificantlyhigherthanthatofthehealthycontrols（P0.05）.③TherewasnocorrelationsbetweentheexpressionsofFasonCD4（+）andCD8（+）TlymphocytesandthoseofCD40L（r=0.311,r=0.517）.④TheexpressionsofCD40LonCD4（+）andCD8（+）TlymphocytesinpatientswithSLEsignificantlydecreasedafterblockagebytheantibodyofFasL（P0.05）;
therewasnodifferenceintheexpressionofFasinpatientswithSLEafterblockagebytheantibodyofCD40L（P0.05）.ConclusionThelevelsofsFasandsCD40LinSLEpatientswerehigherthanthoseofhealthycontrolsandtherewasapositivecorrelationbetweenthem.TheexpressionsofFasandCD40LonCD4（+）andCD8（+）TlymphocytesinpatientswithSLEincreased;
andtheexpressionofFashadapositivecorrelationwiththatofCD40L;
meanwhile,theexpressionofFasregulatedthatofCD40L,whichsuggeststhatbothFasandCD40LareinvoledintheprocessofSLE. Keywords：
systemiclupuserythematosus;
Fas;
CD40L 系统性红斑狼疮（SLE）是一种慢性自身免疫性疾病，引起多器官损害，具有产生多种自身抗体的特点[1]。
Fas和CD40L均属于TNF/NGF受体超家族成员。
Fas是一种细胞凋亡的调节蛋白受体，通过与Fas配体结合，介导细胞凋亡[2]。
CD40L是表达于B细胞或其他抗原递呈细胞（APC）表面的CD40分子的配体，目前认为，共刺激分子CD40-CD40L是为激活淋巴细胞的第二信号系统的组成部分，其在T细胞介导的B细胞活化中具有重要作用[3-4]。
本研究同时检测SLE患者血清sFas和sCD40L水平及外周血CD4（+）和CD8（+）T细胞表面CD40L和Fas的表达，并用抗FasL抗体、抗CD40L抗体分别阻断Fas信号和CD40信号测定CD4（+）和CD8（+）T细胞表面CD40L和Fas的表达，观察了淋巴细胞表面Fas与CD40L表达的相关性及相互之间是否存在表达的调控情况，从而探讨Fas和CD40L参与SLE发病过程的可能尚未被认识的机制。
1资料和方法 1.1研究对象和分组①SLE组：
南京医科大学附属苏州市立医院门诊或住院的SLE患者46例，其中女性42例，男性4例，年龄9～61岁，平均年龄32岁。
其中36例进行血清sFas、sCD40L测定,10例进行T细胞亚群表面Fas与CD40L表达及相关性研究。
所有SLE病例均符合美国风湿病协会（ARA）的诊断标准。
根据临床表现及实验室检查指标，参照SLE疾病活动性指数（systemiclupuserythematosusdiseaseactivityindex,SLEDAI）[5]评分标准，判断SLE的病情活动性，将SLE组患者进一步分为活动期（SLEDAI≥10）及缓解期（SLEDAI10）2个亚组。
②正常对照组:
30例，其中男3例，女27例，平均年龄32.5岁，均为门诊健康体检者。
1.2主要仪器MicroReader4型酶联免疫检测仪,HFsafe-900型生物安全柜;
TC2323型二氧化碳培养箱,Coulter公司流式细胞仪。
1.3主要试剂晶美生物工程有限公司sFas检测试剂盒,BenderMedSystems公司sCD40L检测试剂盒,上海试剂二厂淋巴细胞分离液,GIBCO公司RPMI1640培养液,eBioscience公司抗人FasL、抗人CD40L阻断性抗体,Caltag公司PE-CY5-抗CD3、FITC-抗CD4、FITC-抗CD8荧光标记抗体,eBioscience公司PE-抗CD40L、PE-抗Fas荧光标记抗体。
1.3方法 1.3.1sFas、sCD40L的检测严格按说明书进行操作。
结果判断：
用MicroReader4酶标仪比色，得到光密度（D）值，以标准品浓度作横坐标，D值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点，通过标本的D值可在标准曲线上查出其浓度。
1.3.2细胞分离培养取正常健康体检者和SLE患者肝素抗凝外周静脉血，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用RPMI1640培养液调细胞密度至1×
109/L，加入24孔培养板中37℃、5%CO2培养48h。
SLE患者细胞培养液中纯化抗人FasL抗体和
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