基因工程第三章分子克隆载体PPT资料.ppt

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质粒载体、噬菌体载体的种类和工作原理。

教学方法：

讲授、讨论、计算机辅助教学等讲授、讨论、计算机辅助教学等本章思考题：

本章思考题：

1.列举质粒载体必须具备的列举质粒载体必须具备的4个基本特性。

个基本特性。

2.什么叫穿梭载体？

什么叫穿梭载体？

3.M13系列载体具有哪些优缺点系列载体具有哪些优缺点?

4.黏粒载体具有哪些特点与不足黏粒载体具有哪些特点与不足?

5.质粒如何维持在细胞中的稳定？

质粒如何维持在细胞中的稳定？

主要参考资料主要参考资料:

1.吴乃虎主编吴乃虎主编.基因工程原理基因工程原理（第二版第二版）.北京北京:

科学出版科学出版社社,2002.2.陆德如陆德如,陈永青主编基因工程陈永青主编基因工程.化学工业出版社化学工业出版社,20023.马建岗主编马建岗主编.基因工程学原理基因工程学原理.西安西安:

西安交通大学出西安交通大学出版社版社,20014.美美本杰明本杰明卢因编著卢因编著.基因基因.北京北京:

科学出版社科学出版社,2007.要把一个有用的基因（目的基因要把一个有用的基因（目的基因研究或应用基因）研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（就叫做载体（vector）。

）。

载体载体:

能能与外源与外源DNA片断结合并将之传递到受体细胞而使之片断结合并将之传递到受体细胞而使之复制表达的传递者复制表达的传递者。

包括包括质粒、噬菌体、粘粒载体、质粒、噬菌体、粘粒载体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体（病毒、细菌或酵母菌人工染色体（BAC、YAC）等。

）等。

载体的功能：

1、运送外源基因高效转入受体细胞；

运送外源基因高效转入受体细胞；

2、为外源基因提供复制能力或整合能力；

为外源基因提供复制能力或整合能力；

3、为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。

、为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。

基因工程中的载体应具有如下一些特性基因工程中的载体应具有如下一些特性:

1、能在宿主细胞内进行独立和稳定的能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制自我复制。

在其。

在其DNA中插入外源基因后中插入外源基因后，仍然保持着稳定的复制状态和遗仍然保持着稳定的复制状态和遗传特性。

传特性。

2、在其在其DNA序列中，具有适当的限制性内切酶位点序列中，具有适当的限制性内切酶位点（最好是最好是单一单一酶切位点酶切位点），这些位点位于这些位点位于DNA复制的非必需区内复制的非必需区内，可以在这些位点上插入外可以在这些位点上插入外源源DNA，但不影响载，但不影响载体体自自身身DNA的复制。

的复制。

3、具有能够观察的表型特征具有能够观察的表型特征（有有报告墓因报告墓因），在插入外源，在插入外源DNA后，这些特征可以作为重组后，这些特征可以作为重组DNA选择的标志。

选择的标志。

即容即容易将带有外源易将带有外源DNA的重组体与不带外源的重组体与不带外源DNA的载体区别的载体区别开来。

开来。

4、具有较具有较高的拷贝数高的拷贝数，便于载体的制备。

，便于载体的制备。

5、易易于于从宿主细胞从宿主细胞中中分离，并进行纯化。

分离，并进行纯化。

6、在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失。

不易丢失。

7、载体载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段片段。

第一节第一节质粒载体质粒载体一、质粒的基本特性一、质粒的基本特性质粒质粒（plasmid）：

是是独立于许多细菌及某些独立于许多细菌及某些真核细胞染色体外共价真核细胞染色体外共价闭合环状的闭合环状的DNA分子分子，能独立复制的最小遗传能独立复制的最小遗传单位，大小在单位，大小在1200kb之间之间。

和病毒不同，它们。

和病毒不同，它们没有衣壳蛋白（没有衣壳蛋白（裸裸DNA）。

绝大多数质粒绝大多数质粒DNA是双链环形，它具有是双链环形，它具有3种不同的构型种不同的构型:

当其两条多核当其两条多核苷苷酸链均保持着完整的环形结构时酸链均保持着完整的环形结构时,称之为称之为共共价闭合环形价闭合环形DNA（cccDNA）这样的这样的DNA通常呈现超通常呈现超螺旋螺旋的的SC构型构型（c）;

如果两条多核如果两条多核苷苷酸链中只有一条保酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出持着完整的环形结构，另一条链出现有一现有一至至数个数个缺缺口时，称之为口时，称之为开环开环DNA（ocDNA），此即，此即OC构型构型（b）;

若若质质粒粒DNA经过适当的限制性核酸内经过适当的限制性核酸内切酶切割之后，发生双链断裂而形切酶切割之后，发生双链断裂而形成成线性线性DNA（IDNA），通称，通称L构型构型（a）。

切割切割连接连接切割切割连接连接质粒与宿主细胞的关系质粒与宿主细胞的关系

（1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好友好”的的“借借居居”宿主细胞中，宿主细胞中，既不杀伤细胞，对宿主的代谢活动也无影响，既不杀伤细胞，对宿主的代谢活动也无影响，宿主离开质粒照样的生存下去。

宿主离开质粒照样的生存下去。

（2）质粒离开宿主就无法生存，只有依赖宿主细胞的）质粒离开宿主就无法生存，只有依赖宿主细胞的（酶（酶和蛋白质）帮助，才能完成自身的复制（扩增）、转录。

和蛋白质）帮助，才能完成自身的复制（扩增）、转录。

（33）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能，作为对宿作为对宿主细胞的补偿（主细胞的补偿（“交房租交房租”）。

（4）质粒赋于宿主各种有利的表型（质粒编码蛋白质或）质粒赋于宿主各种有利的表型（质粒编码蛋白质或酶），酶），使宿主获得生存优势，与我们基因工程实验紧密相关使宿主获得生存优势，与我们基因工程实验紧密相关的，如抗生素抗性基因。

的，如抗生素抗性基因。

质粒发现和研究意义质粒发现和研究意义1）理论意义）理论意义质粒能够复制、传递和表达遗传信息，从分子质粒能够复制、传递和表达遗传信息，从分子遗传学观点来看是一种有机体，是比病毒更原始的生命形式，遗传学观点来看是一种有机体，是比病毒更原始的生命形式，是生命起源研究的一块重要基石。

是生命起源研究的一块重要基石。

2）实践意义）实践意义是基因工程的重要载体，能把外源基因（目的是基因工程的重要载体，能把外源基因（目的基因）送到宿主细胞中去克隆扩增或克隆表达。

基因）送到宿主细胞中去克隆扩增或克隆表达。

质粒是可以改造的，可以剪切、剪接的质粒是可以改造的，可以剪切、剪接的，基因工程的重要任，基因工程的重要任务之一就是严格改造质粒的同时，控制质粒不传递，若一个致务之一就是严格改造质粒的同时，控制质粒不传递，若一个致癌质粒可以传递就会传到外都是。

癌质粒可以传递就会传到外都是。

作为基因工程载体的作为基因工程载体的3个特点个特点：

A.都能独立自主的复制；

都能独立自主的复制；

B.都能便利的加以检测（抗生素抗性）；

都能便利的加以检测（抗生素抗性）；

C.都能容易引进宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化都能容易引进宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化（提质粒）。

（提质粒）。

基因工程中主要使用人工构建的质粒。

1、自主复制性、自主复制性质粒质粒DNA携带有自己的复制起始区（携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。

不同的质粒在宿主细胞内的拷贝数也不而自主复制。

不同的质粒在宿主细胞内的拷贝数也不同，少则几个多则几百个不等，当然由于质粒上并没有复制同，少则几个多则几百个不等，当然由于质粒上并没有复制酶的基因，所以其复制需要使用宿主细胞复制染色体酶的基因，所以其复制需要使用宿主细胞复制染色体DNA的的多种酶群。

多种酶群。

2、可扩增性、可扩增性质粒就其复制方式而言分为两类：

松弛型复制及严谨型复质粒就其复制方式而言分为两类：

松弛型复制及严谨型复制。

严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约制。

严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约1几个；

松驰型几个；

松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。

质粒拷贝数较多，可达几百。

严谨控制型严谨控制型松弛控制型松弛控制型拷贝数少，一般拷贝数少，一般10个，分子量大；

个，分子量大；

拷贝数多，拷贝数多，10-200个，分子量小；

个，分子量小；

复制受限，受细菌宿主复制受限，受细菌宿主DNA复制系复制系复制不受细菌复制不受细菌DNA复制系统限制，复制系统限制，统的控制；

统的控制；

当宿主蛋白质合成受抑制时（如培当宿主蛋白质合成受抑制时（如培养中加入抗生素时），其拷贝数可养中加入抗生素时），其拷贝数可猛增至猛增至1000-3000之多，该性质对之多，该性质对基因工程技术十分有利。

基因工程技术十分有利。

严谨控制机理（低拷贝原因），认为严谨控制机理（低拷贝原因），认为基因工程使用松弛型（高拷贝数）基因工程使用松弛型（高拷贝数）是该质粒可以产生阻遏蛋白，反馈抑是该质粒可以产生阻遏蛋白，反馈抑质粒，以获得列多的基因产物。

质粒，以获得列多的基因产物。

制自身制自身DNA合成。

合成。

*拷贝数拷贝数（copynumber）细胞所含的按每一基因组计算的某种细胞所含的按每一基因组计算的某种质粒或基因的数目。

质粒或基因的数目。

3、不相容性、不相容性利用同一复制系统的不同质粒如果被导入同一细胞中，利用同一复制系统的不同质粒如果被导入同一细胞中，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中，就会彼此竞争，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中，就会彼此竞争，它们在单细胞中的拷贝数也会有差异，拷贝多的复制更快，它们在单细胞中的拷贝数也会有差异，拷贝多的复制更快，结果在细菌繁殖几代之后，细菌的子细胞中绝大多数都含有结果在细菌繁殖几代之后，细菌的子细胞中绝大多数都含有占优势的质粒，因而这两种质粒中只能有一种长期稳定地留占优势的质粒，因而这两种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中，这就是所谓的质粒不相容性。

在细胞中，这就是所谓的质粒不相容性。

4、可转移性、可转移性在天然条件下，很多天然质粒都可以通过细菌接合在天然条件下，很多天然质粒都可以通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内，这种转移依作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内，这种转移依赖于质粒上的赖于质粒上的tra基因产物基因产物（移动基因移动基因mob、转移基因、转移基因tra、顺、顺式作用元件式作用元件bom及转移缺口位点及转移缺口位点nic）（接合型质粒接合型质粒）。

基因工。

基因工程中常用的质粒载体缺乏转移所需的基因（程中常用的质粒载体缺乏转移所需的基因（mob基因），不基因），不能通过接合作用在细胞间传递，但可采用人工方法转化到细能通过接合作用在细胞间传递，但可采