基因工程在药用植物次生代谢物研究中的应用基因工程在药用植物次Word下载.docx

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【关键词】次生代谢物；

功能基因组学；

转录组学；

代谢组学；

代谢工程

植物在长期进化过程中与环境相互作用，产生大量不同种类的小分子有机化合物——次生代谢物（secondarymetabolites）。

次生代谢物在植物适应特殊生态环境、对抗生物或非生物压力等方面发挥着重要作用，如抵御病虫害、适应生态环境变化、诱导授粉或防紫外线灼伤等[1-2]。

很多次生代谢物化学结构复杂而独特，具有特殊的生物活性，是药用植物的主要活性成分[3]。

药用植物在药物研发中应用广泛，是传统中药主要来源，其次生代谢物是新药、新先导化合物（drugleads）、新化学实体（newchemicalentities，NCEs）

的重要来源[4-5]。

从生物合成的起源来看，药用植物次生代谢物可分为5大类：

多聚酮类（polyketides）、异戊二烯类（isoprenoids）、生物碱类（alkaloids）、苯丙烷类（phenylpropanoids）、黄酮类（flavonoids）。

多聚酮类由乙酸-丙二酸途径（acetate-malonatepathway）产生；

异戊二烯类（包括萜类和固醇类）由五碳前体异戊烯焦磷酸（isopentenyldiphosphate，IPP）经过经典的甲羟戊酸途径（mevalonicacidpathway，MVApathway）或MEP代谢途径（methyl-erythritolphosphatepathway）产生；

生物碱类由不同种类的氨基酸合成；

苯丙烷类含有1个C6-C3单元，起源于芳香氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸；

黄酮类由苯丙烷类与多聚酮类相结合的途径合成[6]。

不同种类的药用植物次生代谢物在药物开发中均有应用[7]。

然而，来源于药用植物的次生代谢物往往含量低，且天然药用植物资源有限，增加了药物开发的难度[7]。

药用植物次生代谢产物的生物合成往往包含多个步骤，过程长而复杂，有多种酶参与，至今仍有很多问题悬而未决。

目前，药用植物中仅有少数次生代谢途径（如黄酮类，吲哚三萜，异喹啉生物碱）经过多年经典生物化学研究已有较深入的认识[8-9]，而大部分次生代谢途径还有待进一步阐明，阻碍了生物技术生产次生代谢物的成功应用。

功能基因组学方法是全面探索生系统的有力工具，是发现次生代谢物生物合成相关基因及阐明次生代谢途径的有效手段[10]，将成为药用植物次生代谢物研究以及中药现代化研究的发展趋势之一[11-12]。

一、药用植物次生代谢物的获得途径

总的来说，药用植物次生代谢物的获得途径有①从植物（包括野生和栽培植物）中提取分离；

②对结构已知的次生代谢物寻求化学合成或结构改造；

③从植物细胞或组织培养物中获得；

④代谢工程生产。

目前，从植物中提取分离仍是获得次生代谢物最主要的途径，而且其中大约2/3来源于野生资源[13]。

然而，大多数次生代谢物在植物中含量低，且只在特殊组织部位、特定生长阶段或生长环境下积累，过度依赖野生资源会危及濒危物种、破坏环境。

药用植物栽培在一定程度上可以缓解这些问题，但由于生长环境要求高、耗时长、劳动量大等原因，使得药用植物栽培成本较高、难度较大[14]。

大部分次生代谢物结构复杂，常含有特异的立体化学结构（stereochemistry），使得化学全合成往往不可能或者经济上不可行。

在基于次生代谢物作用机制知识的基础上合成作用相似的替代物，或者对次生代谢物进行结构修饰，是药物开发中一种经济可行的策略。

例如，以薯蓣皂苷元（diosgenin）为基本骨架，经化学修饰开发出大量类固醇激素类药物。

作为获得药物植物次生代谢物一种可能的替代方法，运用细胞或组织培养物产生有商业价值的次生代谢物的研究已广泛开展。

虽然许多不同种类的药用植物细胞或组织培养体系已经被确定，但它们常常并不能产生足够量的目标次生代谢物[15]。

可能的原因如下：

次生代谢物细胞内毒性高，导致其在培养物中往往并不积累或者含量很低[16]；

培养物容易受后天变化（epigeneticchanges）的影响，产物水平不稳定，使得依靠经验摸索选择高产、稳定的培养体系难度较大。

通过筛选选择高产率细胞系、优化培养基、加入茉莉酸甲酯等诱导因子、运用毛状根培养等方法能够在一定程度上提高目标次生代谢物产量[17]。

成功的例子有：

运用紫草Lithospermumerythrorhizon细胞悬浮培养生产紫草素（shikonin）；

从罂粟Apaversomniferum细胞培养生产血根碱（sanguinarine）等。

但由于产量以及生产成本等问题，目前这种方法商业成功率仍然非常有限。

代谢工程为产生目标次生代谢物、提高其含量提供了新的前景。

调控次生代谢途径要求彻底认识其整个生物合成途径，详细了解代谢途径中控制启动和流通的调控机制。

目前，这种方法已经被成功的运用于微生物生产本体或异源次生代谢物[18]。

例如，在大肠杆菌Escherichiacoli中生产抗疟疾成分青蒿素的前体青蒿酸（amorphadiene）[19]。

然而，药用植物与微生物不同，通常次生代谢途径更长，酶催化步骤更多，因此阻碍了代谢工程在药用植物中的应用。

功能基因组学研究将最终揭示次生代谢物的生物合成途径，为药用植物代谢工程以及细胞或组织培养与代谢工程相结合的途径产生次生代谢物奠定坚实的理论基础。

二、功能基因组学的基本研究工具

拟南芥、水稻全基因组测序完成，其他几种植物如杨、苜蓿、莲、土豆、玉米等序列信息的发现[20-22]，有力推进了基因组学的发展。

然而，仅仅依靠大量序列信息，许多基因的功能无法阐明。

通过改变单个因素或基因探索基因功能的方法效率较低、成本较高，这要求大规模分析基因功能[23]，从而催生了功能基因组学。

功能基因组学（functionalgenomics）应用多重平行的方法，包括转录组学（transcriptomics）、蛋白质组学（proteomics）、代谢组学（metabolomics），采用高通量模式在基因组或系统水平上全面研究分析基因功能，是全面探索生物系统的有力工具，最终将建立起基因组（genome）和表型组（phenome）之间的联系[10,24]。

转录组学在整体水平上研究细胞中基因转录情况及转录调控规律，其发展使得全面系统研究基因表达、发现新基因、诠释基因功能成为可能。

常用的转录轮廓分析方法有：

差异性显示（differentialdisplay），cDNA微阵列（cDNAmicroarray），基因芯片（genechip），表达序列标签（expressionsequencetags，EST）分析，基因表达的系统分析（serialanalysisofgeneexpression，SAGE），大规模平行测序技术（massivelyparallelsignaturesequencing，MPSS），cDNA-扩增片段长度多态性（cDNA-amplifiedfragmentlengtpolymorphism，cDNA-AFLP）等[22,25-26]。

cDNA-AFLP是Bachem等1996年在AFLP（amplifiedfragmentlengthpolymorphism）的基础上发明出来的一项RNA指纹图谱技术，基本原理是对cDNA限制性酶切片段进行选择性扩增，通过扩增片段获得基因表达信息[27]。

cDNA-AFLP与基于杂交的转录图谱技术cDNA微阵列和基因芯片相比，最显著的优点为不需要事先知道基因组序列信息、灵敏度高、特异性高、重复性好、启动成本相对较低，在基因表达研究方面可有效替代后两者[28]。

cDNA-AFLP已逐渐成为探索基因序列信息相对缺乏的药用植物基因表达的有力工具[29-30]，主要应用于定量基因表达分析，新基因发现，表达数量性状基因坐（quantitativetraitloci，QTL）作图等方面，适用于任何物种[25]。

蛋白质组学在大规模研究基因表达、揭示蛋白质功能、探索酶的催化调控作用等领域发挥着举足轻重的作用，主要的分离分析方法有：

二维凝胶电泳（twodimensionalgelelectrophoresis），质谱技术，包括基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrixassistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，MALDI/TOFMS）、电喷雾离子化质谱（electrosprayingionization-massspectrometry，ESI-MS）等。

二维凝胶电泳技术是高效分离分析多种蛋白的主要手段。

质谱技术灵敏度、特异性高，主要应用于精确鉴定蛋白质[31]。

由于蛋白质自身结构复杂、特异，且存在相互作用，蛋白质组的研究常需要结合二维凝胶电泳、质谱技术以及用于研究蛋白质相互作用的分析技术，如酵母双杂交技术、蛋白质芯片[32]。

代谢组学的形成和发展使得对于代谢网络的整体动态变化的衡量成为可能或者更接近于真实，尤其适合于特定条件下的代谢表型（metabolicphenotypes）的研究[33-34]，并且迅速成为阐释基因功能、全面了解细胞对生物环境反应的关键工具[35]，也是药用植物、中医药现代化研究非常重要的手段[36-37]。

常用的分析方法有：

核磁共振（nuclearmagneticresonance，NMR）、气相色谱-质谱联用（gaschromatographycoupledwithmassspectrometry，GC-MS）、液相色谱-质谱联用（liquidchromatographycoupledwithmassspectrometry，LC-MS）、傅立叶质谱（Fouriertransformmassspectrometry，FTMS）和毛细管电泳-质谱联用（capillaryelectrophoresiscoupledwithmassspectrometry，CE-MS）等[38]。

近年来又发展出了串连质谱、液相色谱与核磁共振联用等新技术。

这些分析方法各有优缺点，NMR快速、选择性好、代谢物结构鉴定方便，但灵敏度相对较低、检测动态范围窄；

基于分离和质谱联用的技术灵敏度高、专属性好，但样品前处理及分析需要相对较长的时间。

选择合适的分析技术需要综合考虑代谢物谱的特征，分析速度、选择性和灵敏度[39-40]。

三、药用植物功能基因的挖掘

对于药用植物来说，由于基因组序列信息及其相关数据库、功能基因组学研究工具的缺乏，其次生代谢物相关基因的全面研究几乎未见报道。

整合转录组学与代谢组学的功能基因组学方法是该研究领域的一个突破口[6]（图1）。

使用茉莉酸甲酯（methyljasmonae，MeJA）、水杨酸（salicylicacid，SA）、壳聚糖（chitosan）或重金属（heavymetals）等刺激因子处理未分化的细胞通常能够提高次生代谢物产量[11-12]。

假设目标次生代谢物的含量提高的同时，与这些成分生