水稻稻瘟病及其抗病基因的鉴定分子标记的研究进展Word下载.docx

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目前，我国北方粳稻面积有7000万亩，约占全国水稻播种面积的17％，其中东北地区粳稻面积4700万亩左右。

与南方籼稻相比，北方粳稻在品质和商品量上占有独特优势，其发展潜力巨大。

因此有效控制和防治稻瘟病害具有十分重要的意义。

为了减少病虫害造成的水稻产量损失，人们多采用综合防止的措施，最主要的技术有两种：

一是利用不断更新换代的化学农药；

二是选择对主要病虫有抗性的良种。

前者不仅成本较高而且污染环境，毒害人体，不利于现代农业的持续发展。

因此改良水稻品种的抗性成为水稻育种工作者的重要目标之一。

长期的生产实践证明，水稻抗稻瘟病品种的选育和利用是防治稻瘟病行之有效的措施。

但由于引进和新育成的抗稻瘟病品种的单一化和稻瘟病生理小种遗传的复杂性和致病力的多样性，往往造成抗病品种在推广种植3～5年后即因产生能侵染该品种的优势小种，最终导致新品种抗性丧失（Ahn等，1996）。

因此加快抗病育种的进程，加强对稻瘟病的防治研究是一项十分迫切而重要的任务。

1.1水稻稻瘟病的研究进展

1.1.1水稻稻瘟病病原菌研究进展

1.1.1.1水稻稻瘟病菌致病型（生理小种）的研究

早在1922年，日本Sasaki（Yamada，1985）在选育抗病品种中就已发现了稻瘟病病菌（Pyriculariagarise）的生理分化现象。

此后，各国先后开始了对水稻稻瘟病菌的研究，大致经历了以下几个阶段：

第一阶段是各国用传统方法进行的本国稻瘟病菌鉴别品种的筛

选及病原菌致病型（生理小种）的鉴定阶段。

日本、美国、印度、菲律宾、朝鲜等国先后于上世纪50～60年代就各自确定了一套鉴别品种（Atkins等，1967），并进行了稻瘟病菌小种的研究。

如日本于1961年制定了12个品种为一套的鉴别品种，共鉴定出了18个小种。

1963～1965年，美国和日本又进一步协作研究确定了一套国际鉴别品种（Atkins等，1967）。

我国稍晚一些，在70年代末才开始了全国范围内的鉴定品种的筛选和稻瘟病菌生理小种的鉴定工作（全国稻瘟病菌生理小种联合实验组，1980），从中选出特勃、珍龙13、四丰43、东农363、关东51号、合江18号和丽江新团黑谷7个品种为中国稻瘟病菌生理小种的鉴别品种，同时鉴定出7群43个生理小种。

但由于使用的鉴别品种不同，各国的小种名也各不相同。

我国小种的分类和命名法与国际小种的体系大致相同，是以鉴别品种的抗性群而先分群，再编号。

第二个阶段是单基因鉴别品种产生及应用阶段。

单基因鉴别品种和鉴别菌系都是根据基因对基因学说而鉴别的，它不仅鉴别能力强，而且鉴别品种可以鉴别菌系，反过来鉴别菌系也可以区分品种。

目前，各水稻生产国和地区都有自己的一套鉴别品种，在这方面的研究，日本己居于世界前列。

1976年，日本的山田昌雄率先提出了9个为一套的单基因鉴别品种，并从2245个菌株中鉴定出23个小种。

我国于1992年由段永嘉筛选出了云玉一号（Pi-a）、高梁稻（Pi-i）、关东51（Pi-k）、楚粳1号（Pi-km）、滇榆1号X福锦（Pi-z）、大理782（Pi-ta）、单83-3（Pi-ta2）、城堡1号（Pi-zt）等9个为一套的单基因鉴别品种，在鉴别能力上与日本9个单基因鉴别品种等同而优于我国原有的7个鉴别品种。

小种的命名法则采用Gilmour氏的8进位标记法（Gilmour，1973）。

第三个阶段是抗稻瘟近等基因系鉴别品种的选育和应用阶段。

由于近等基因系清除了遗传背景对鉴定结果的影响，从而使得鉴定结果更具有说服力。

国际水稻所（IRRI）于1992年选育了一套以籼型高感品种C039为背景的近等基因系（Near-isogeniclines，NILs）（Mackill&

Bonman，1992）。

而我国于1995年由凌忠专等选育了一套以粳型高感品种丽江新团黑谷为背景的近等基因系。

籼粳两套鉴别品系的选育成功为稻瘟病菌的准确鉴定及水稻抗稻瘟病育种提供了良好的基础。

陈惠兰（2000）利用两套鉴别品系对我国中部和南部12个省份的稻瘟病菌群体的致病型组成进行了鉴定，从而为在不同稻区有针对性地利用不同的抗性基因进行水稻抗病育种提供了实验依据。

1.1.1.2稻瘟病菌遗传多样性的研究

实践己证明，利用抗病品种是经济有效的防治措施，然而新推广的抗病品种通常在三、五年内就成为感病品种。

正因为如此，有必要深入开展对稻瘟病菌的鉴别、分类以及变异性和稳定性的研究。

根据菌株在鉴别品种上的反应来划分小种，所划分的小种往往因鉴别品种的不同而异。

另外，在接种过程中环境及外界条件的干扰也会影响研究结果，使之相互矛盾。

因此，只有建立一个统一的生物学测定分析标准，并从稻瘟病菌本身的遗传学进行研究，才能避免在对稻瘟病菌的遗传多样性和变异性研究中出现相互矛盾的结果。

Hamer等（1989）首先报道了从稻瘟病菌基因组中克隆到了一组散布的中等重复序列的DNA片段（即MagnaportheGriseaRepeat，MGR），在稻瘟病菌株间具有丰富的多态性，可以鉴别出不同来源的稻瘟病菌。

此后，Hamer和Levy研究组与世界多国科学家广泛合作，开展了稻瘟病菌的指纹分析，包括哥伦比亚、菲律宾、中国等多个国家（沈瑛等，1996；

Levy等，1991；

Levy等，1993）。

我国利用稳定的日本菌株北1发展了一套自己的具有高度多态性且散布的重复顺序克隆，命名为POR（源于Pyricylariaoryzaerepeat）（朱衡等，1994）。

这为我们进一步从分子水平认识稻瘟菌群体遗传结构，开展抗瘟持久化研究与利用奠定了良好的基础。

1.1.2水稻稻瘟病抗性遗传研究

水稻稻瘟病抗性遗传是很复杂的：

从寄主与病原菌生理小种的关系上，可分为垂直抗病性和水平抗病性；

从抗病性遗传的方式，可分为质量遗传的抗病性（单基因抗病性）和数量遗传的抗病性（多基因抗病性）。

垂直抗病性又叫“小种特异性抗病性”或“专化性抗病性”，其特点是寄主对于某些生理小种能够高度抵抗，但对于另一些生理小种则高度感染，即对于病原菌不同生理小种具有“特异”反应或“专化”反应。

垂直抗病性的遗传往往是单基因或少数主基因决定的简单遗传，杂种后代分离比较简单。

而水平抗病性则对不同生理小种没有什么“专化”和“特异”反应，所以又叫“非特异性抗病性”或“非专化性抗病性”。

在遗传上，水平抗病性大多是微效多基因所决定的数量遗传，其杂种后代分离比较复杂。

迄今的研究表明，稻瘟病抗性可由单个或多个显性主基因和微效多基因（QTL）控制（Wang等，1989），亦有个别隐性基因控制的报道（Yu等，1987）。

到目前为止，各国学者和科学家已从不同抗性资源中鉴定出大约50个抗稻瘟病主基因位点和10个微效基因位点。

主效基因抗性是具有质量效应、完全遗传和小种专化性的抗性。

早期，日本学者Kiyosawa等用经典遗传学的方法在8个位点定位了13个完全抗性基因。

随着分子生物学的发展，借助各种DNA分子标记技术定位了一系列稻瘟病抗性基因。

Yu等（1991，1996）用近等基因系（NILs）定位了Pi-1（t），Pi-2（t）和Pi-4（t）3个基因，它们分别位于第11，6和12染色体上，标记与目的基因的图距分别为14.0cM，2.8cM和15.3cM。

Mackill和Bowman（1992）在近等基因系C104PKT中发现1个新的抗稻瘟病位点，能抗IRRI分离的稻瘟病菌小种P03-82-51，命名为Pi-3（t）。

Wang等（1994）利用RILs群体定位了2个稻瘟病抗性主效基因Pi-5（t）和Pi-7（t），分别位于第4和第11染色体上。

Yu（1991）还在来源于另一个组合的DH群体中定位了Pi-6（t）基因，该基因也位于第12染色体上。

朱立煌等（1994）利用RAPD标记定位了抗稻瘟病基因Pi-zh[Pi-11（t）]，它位于第8染色体上，是首次在第8染色体上发现的稻瘟病抗性主效基因。

郑康乐等（1995）定位了1个抗稻瘟病主效基因Pi-h-1（t），它位于第12染色体上。

自稻瘟病抗性基因命名规范化以来，基因数目至少已经注册到第20号即Pi-20（t）（Iwata，1997），而且每年都有新的稻瘟病抗性基因被发现和命名。

目前，有些抗性基因被定位于同一条染色体上很靠近的区域，由于各个研究组采用的材料不同（包括水稻和稻瘟病菌株），以及材料缺乏足够的交流，这些基因的等位性还研究得不够。

有迹象表明，这些位点上的基因要么是等位的，要么是紧密连锁的。

实际上基因簇的存在是许多植物抗性基因的共同特点，是植物和其病原菌长期协同进化的产物，其有重要的生物学意义。

由于仅具有一个主效基因的抗性容易被新的病原菌小种克服而导致感病，而在水稻—稻瘟病菌系统中，高水平的部分抗性被认为是与持久抗性相关联的（Yeh&

Bonman，1986；

Bonman等，1992），因此，由微效多基因或数量性状位点（QTL）提供的部分抗性逐渐受到人们的重视。

微效多基因抗性是控制水稻对稻瘟病菌的不完全抗性，是由许多微效的起累加作用的基因控制的部分抗性，表现为降低病斑数目和病斑大小，一般可以对多种小种有效，为小种非专化性抗性。

早期，由于数量性状本身的复杂性体现在易受环境条件的影响，微效基因的效应容易被品种的主效基因遮蔽，以及遗传研究方法的局限性等，使得持久抗性品种的遗传背景依然没有很好地被阐释。

但随着分子生物学与统计学的不断发展，使得提供部分抗性的因子作为一个分开的QTL来研究成为可能和必然。

1994年，Wang等（1994）发现持久抗瘟品种Moroberekan中除了含有主效基因外，还存在与抗瘟性有关的QTL，并利用分子标记对这些QTL进行了定位，进一步研究发现这些QTL共解释了60%的病斑数目所表现的变异。

由此可见，分子标记种类和数量的大量涌现及高密度分子标记连锁图的成功构建，在数量性状位点的定位中发挥了重大的作用。

1.1.3水稻稻瘟病抗性基因的克隆

目前己克隆的水稻稻瘟病抗性基因有两个：

Pi-b和Pi-ta（Wang等，1999；

Bryan等，2000）。

Pi-b是源于籼稻的显性抗性基因，对绝大多数日本生理小种高抗，被定位于第2染色体长臂近末端。

1996年，Miyamoto等对Pi-b进行了精细定位，Pi-b与RFLP标记RZ123及RAPD片段b-1共分离，而这两个完全共分离标记间距离为85kb。

此外，另一个标记RZ213在靠近端粒的一边距b-1片段1.9cM，而标记G1234在离中心粒的一边距b-1只有0.5cM。

1999年，Wang等将Pi-b定位于两个RFLP标记S1916，G7030之间，图距分别为0.015cM和0.045cM。

并且得到3个与Pi-b共分离的RFLP标记G7010、G7021、G7023。

在此基础上，采用图位克隆法对Pi-b基因进行了分离鉴定。

序列分析表明：

Pi-b蛋白编码的是一个NBS类细胞质受体，因而属于NBS/LRR类植物抗病基因家族的一员。

同时发现Pi-b蛋白的N端有一个含有激酶la、2和3a重复单元的NBS区域。

此外，还发现LRR中部聚集了8个半胱氨酸残基，同时获悉温度、光照等环境条件的变化都会诱