热原和细菌内毒素的区别docWord文件下载.docx

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其缺点：

①标准化程度低，无法判断检查样品中存在的热原质到底是什么或是哪一种物质。

②由于试验动物家兔是处在被细菌污染的环境中，通过吸入或皮肤感染细菌内毒素而被免疫，导致动物的个体差异较大。

③试验动物受到药品的药理活性干扰，而影响体温变化（如放射性药品、抗生素、生物制品等），实验结果难以判断。

④设备及实验费用昂贵（如建设动物房、水电、动物饲料等耗费），做一种药品需要几百元/次，而鲎试剂仅几十元/次。

综上情况分析，鲎试验法可避免以上动物热原检查法的不足，该技术的成功和应用真可谓是药品质量监控一场大革命。

什么是热原？

目前国内外仍未有统一的认识，但从国内外文献报道中，一个共同的意见，都普遍认为：

它是指细菌内毒素的脂多糖。

欧洲药典委员会副主席J.Van 

Noordwijk提出：

“严格地讲，不是每一种热原都具有脂多糖的结构，但所有已知的细菌内毒素脂多糖都有热原活性”。

在药品生产质量管理规范（GMP）条件下，药品生产的质量控制一般可以接受的观点是：

不存在细菌内毒素意味着不存在热原。

二、细菌内毒素（Endotoxin） 

细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（Lipoply 

Saccharide）和微量蛋白（Protein）的复合物，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。

其化学成分广泛分布于革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、布氏杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌、沙门氏菌等）及其它微生物（如衣原体、立克次氏体、螺旋体等）的细胞壁层的脂多糖，其化学成份主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。

（附图1） 

<

一>

、O—特异性链：

位于脂多糖分子最外层的多糖链，是由3—5个单糖（一般不多于25个）连成为一个多糖链。

其单糖包括戊糖、氨基戊糖、已糖、氨基已糖、脱氧已糖等，单糖的种类、位置和排列顺序和空间构型，因菌种不同而异。

因此，它决定菌体热原的特异性。

二>

核心多糖：

核心多糖的变异性较小，位于类脂A和0—特异性链（内层）之间，在结构上分为内核心和外核心。

外核心含有数种己糖，包括葡萄糖、半乳糖、乙酰氨基葡萄糖等组成。

内核心含有庚糖及特殊的酮糖（3-脱氧-D-甘露糖-辛酮糖KDO）。

这部分结构对不同菌株的LPS基本相似，而且KDO是以不耐酸的酮糖链与类脂A的氨基葡萄糖连接，是构成内毒素脂多糖的核心部分。

三>

类脂A：

位于LPS分子结构的外层，是由氨基葡萄糖、磷酸和脂肪酸（10—18C）组成，故称之为糖磷脂，也是细菌外膜的一种，形成单体聚合物。

具有疏水性（强）和亲水性（弱）的双相性。

但是，类脂A可从O-特异链及核心多糖分离出来，游离的类脂A可自身凝聚成大分子的复合体而难溶于水，并具有生物活性。

所以，类脂A（Lipida）是内毒素多种生物活性或毒性反应的主要基团。

该基团没有种属特异性，所以各属细菌的类脂A结构相似，其毒性反应相似。

如发热、血液流动力学改变、弥漫性血管内凝血，并导致休克等。

由于类脂A有4条主链和2条支链的脂肪酸与内酰胺连接组成，所以提纯的内毒素LPS是极为不稳定的。

这就要求内毒素应在低温条件下保存，在工作中内毒素稀释应尽可能地缩短时间，并要现配现用。

三、内毒素的生物活性与疾病的相关性 

据文献报道，在很早期（约19世纪末）的意大利学者Centanne通过菌属自溶的方法，从革兰氏阴性杆菌中提取出一种类似毒素的物质，因为这种物质对动物体产生致热活性的同时，亦产生出一种病理学病性反应，而被命名为致热毒素（Pyrotoxina）。

同时由德国的Buchner也从多种细菌中提取到相似的致热毒素，并证实了这种毒素在导致白细胞数目的改变同时，具有增强机体对细菌感染时的免疫能力。

因此建立了“发热疗法”。

在美国纽约的临床医师，William 

B•Coley用加热法杀死录杆菌和化脓性链球菌，将上清滤液用于各种恶性肿瘤（特别是肉瘤）的治疗，取得较好的疗效。

他将这种细菌上清液命名为Coley氏毒素。

此后murrayJ.Shear 

证实Coley氏毒素中具有抗肿瘤作用的物质为内毒素。

直到1933年Boivin等学者在研究鼠伤寒杆菌的致病机理时，从鼠伤寒杆菌中提取出内毒素。

在50年代以后，对内毒素的化学成分和化学结构的研究得到迅速发展。

经过大量实验表明，内毒素具有极强的生物学活性，特别是革兰氏阴性菌感染和静脉注射提取的内毒素溶液时，可导致动物体发生内毒素休克和死亡。

内毒素的致病机理，主要是由于革兰氏阴性杆菌（如大肠杆菌、沙门氏杆菌、伤寒杆菌，布氏杆菌、变形杆菌金黄色葡萄球菌等）和其它微生物（病毒、立克次氏体、衣原体螺旋体等）感染时，这类菌属随病灶渗液进入血液循环，并扩散到各种组织器官和体液细胞内繁殖，这类菌属在体内死亡和解体后，才稀放出大量的细菌内毒素脂多糖（LPS），据初步实验表明，当机体内毒素浓度國值 

>

0.005ng/ml时,可诱生内源性热原质如肿瘤坏死因子、白细胞介素和β2—干扰素等。

这些因子刺激体温调节中枢导致机体发热，细菌内毒素直接或间接作用于肝脏和胰腺时，可使肝细胞损伤，使糖原异生酶（如葡萄糖—6—6磷酸酶、糖原合成酶）的活性降低，抑制糖原的异生和分解。

同时内毒素作用于胰腺导致胰腺功能障碍，并形成胰岛素抵抗，造成血糖升高致使并发心肌炎和心肌肿大的系列高血糖症状。

所以，革兰氏阴性菌属感染或在病灶中的细菌进入体液细胞繁殖，当其死亡或解体后产生的内毒素，可多次进入血液，引起反复发作，其病理变化极为广泛，几乎所有的器官和组织都可被侵犯，而引起各器官的功能障碍。

其中以网状内皮系统最常见，淋巴、脾、肝、肾、骨髓中均有上皮细胞增生，形成肉芽肿，以肝脏有肉芽肿外，还可发生冲血、水肿和肝细胞坏死，最终导致肝硬化的发生。

其它器官亦有相似的毒性反应。

热原系指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。

它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。

这里所指的“热原”，主要是指细菌性热原，是某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。

致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能产生热原。

热原通常是磷脂多醇与蛋白质结合而成的复合物。

磷脂多醇是复合物的活性中心，致热作用最强。

其化学组成因菌种不同而有所差异。

分子量为5×

104～5×

105，分子量越大致热作用也越强。

注入人体的注射剂中含有热原量达1μg/kg就可引起不良反应，发热反应通常在注入1小时后出现，可使人体产生发冷、寒颤、发热、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至40℃以上，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。

该现象称为“热原反应”。

热原没有多少这一概念， 

《中国药典》2005年版规定热原检查采用家兔法，细菌内毒素检查采用鲎试剂法。

1、热原检查法 

由于家兔对热原的反应与人基本相似，目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。

《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。

检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。

家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml,试验结果接近人体真实情况，但操作繁琐费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控，且不适用于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性药物制剂。

2．细菌内毒素检查法 

细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法．细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。

细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法，前者利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素，后者包括浊度法和显色基质法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来测定内毒素。

鲎试剂法检查内毒素的灵敏度为0.0001μg/ml,比家兔法灵敏10倍，操作简单易行，试验费用低，结果迅速可靠，适用于注射剂生产过程中的热原控制和家兔法不能检测的某些细胞毒性药物制剂，但其对革兰阴性菌以外的内毒素不灵敏，目前尚不能完全代替家兔法

一 

热原（pyrogen）是微生物产生的内毒素，是由磷脂、脂多糖和蛋白质组成的复合物，微量即可引起恒温动物体温异常升高。

其中脂多糖具有很强的热原活性。

由革兰氏阴性杆菌产生的热原致热能力最强，真菌、病毒也可以产生热原。

　　一、热原的性质及除去热原的方法

　　1.高温法

　　热原的耐热性能良好，60℃加热1h不被分解破坏，100℃不降解，但180℃3～4h、200℃60min或250℃30～45min可使热原彻底破坏。

因此耐热物品如玻璃制品、金属制品、生产过程中所用的容器和其它用具以及注射时使用的注射器等，均可采用此法破坏热原。

但在通常使用的注射剂热压灭菌条件下不足以破坏热原。

　　2.吸附法

　　热原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。

由于活性炭性质稳定、吸附性强兼具助滤和脱色作用，故广泛用于注射剂生产，但应注意吸附药液所造成的主药的损失。

　　3.超滤法

　　热原分子量为1×

106左右，体积较小，约1～5nm，可以通过一般滤器和微孔滤膜，但采用超滤法如用3.0～15nm超滤膜可将其除去。

　　4.蒸馏法

　　热原能溶于水但不挥发，但可随水蒸气的雾滴进入注射用水中，因此制备注射用水时，原水中的热原可经蒸馏除去，但需多次蒸馏，，并加有隔沫装置，单次蒸馏往往效果不理想。

　　5.酸碱法

　　热原能被强酸、强碱、强氧化剂破坏。

玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、输液瓶等可用重铬酸钾硫酸清洁液或稀氢氧化钠处理，破坏热原。

　　6.其它

　　包括离子交换法、凝胶滤过法、反渗透法等。

　　二、热原的检查方法

　　《中国药典》2005年版规定热原检查采用家兔法，细菌内毒素检查采用鲎试剂法。

　　1.热原检查法

　　由于家兔对热原的反应与人基本相似，目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。

　　《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的 

限度是否符合规定。

家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml，试验结 

果接近人体真实情况，但操作繁琐费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控，且不适用于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性药物制剂。

　　2.细菌内毒素检查法

　　细菌内毒素