益生元因可增加肠道益生菌的种群数量文档格式.docx

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超氧阴离子自由基清除实验及铁离子螯合实验评价人参多糖与植物乳杆菌C88

联合使用的体外抗氧化活性，结果表明人参中性多糖与人参酸性多糖分别与植物乳杆菌C88联合使用均具有明显的抗氧化活性，且酸性多糖活性高于中性多糖。

另外，以自然衰老小鼠作为动物模型，通过体内试验检测人参酸性多糖联合植物乳杆菌C88的体内抗氧化活性，结果表明联合用药可抑制衰老小鼠血清及肝组织中中丙二醛（MDA）的形成，提高超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）活性及总抗氧化能力（T-AOC）。

研究结果表明人参酸性多糖联合益生菌C88可明显增强免疫抑制小鼠吞噬

细胞的吞噬能力及迟发型超敏反应结果，小鼠血清白细胞介素-2（IL-2）、白细

胞介素-4（IL-4）、干扰素-Y（INF-Y、肿瘤坏死因子-a（TNF-a），免疫球蛋白-g

（IgG、含量明显升高，白细胞介素-10含量明显下降，并且均具有一定的剂量依赖性，同时联合用药组的作用效果要明显强于酸性多糖单独用药组。

4C）。

收集沉淀，加尽量少蒸馏水充分溶解，离心收集上清液，重复3次后，硫酸-苯酚法显色检测基-80C冷冻后干燥，得粗人参多糖（WGP）。

称取干燥人参根粉末200g，按1:

10比例加入蒸馏水浸泡过夜，100C提取两次，每次2小时，合并提取液并过滤（6层纱布），浓缩滤液至800mL，加入3倍量无水乙醇醇沉，过夜（

（20min,3800rpm,4C），本无多糖，合并上清液，于121.2人参粗多糖分离纯化

称取上述制备的人参总多糖加水溶解，离心，取上清，重复3次，合并上清

液，弃沉淀，利用DEAE-纤维素离子交换层析柱，分别以蒸馏水和0.5MNacl

为洗脱剂。

上样后，首先以蒸馏水进行洗脱，后以NaCI溶液（0.5M、进行洗

脱。

洗脱液利用自动部分收集器收集，合并含多糖的洗脱液部分（检测方法：

硫酸-苯酚显色法），透析（透析袋分子量3500Da）2-3天后于-80C冷冻干燥，分别得中性多糖（WGPN）及酸性多糖（WGPA）,收集备用。

1.2.2人参多糖益生元活性评价

122.1菌株来源及培养基

菌株来源：

菌株“C分离于内蒙古奶豆腐，菌株“S”离于东北传统发酵酸菜。

上述菌株均已通过AP150CHL试剂盒及16SrDNA序列分析鉴定为植物乳杆菌。

配制含人参多糖的SDM培养基时除添加葡萄糖外，其它均同。

分别以葡萄糖、人参酸性多糖、人参中性多糖为碳源，配制相同浓度（2g/L）的SDM培养基。

1.2.2.2人参多糖对植物乳杆菌益生元活性测定

菌株分别用上述培养基进行培养，初步筛选出生长状况相对良好的菌株并测定菌株生长曲线。

生长曲线测定方法：

无菌操作条件下，将已配制的含不同人参多糖或葡萄糖的SDM培养液分装于无菌10mLEP管中，每管3mL，按3%接菌量，于37r培养箱培养，于培养0、4、8、12、16、20小时时测定OD600值。

分别将不同时间段培养液取出后离心（4000rpm,5min，4C）得菌泥，加入等体积的生理盐水（0.85%NaCI,3ml），充分混匀后，利用紫外-分光光度计于600nm测定OD值，记录不同菌株的生长情况，筛选出菌株生长趋势最为明显的菌株。

1.2.3短链脂肪酸分析测定

短链脂肪酸的测定根据Schneider等［59］的描述，禾U用气相色谱进行测定。

分别用人参酸性多糖SDM培养基及人参中性多糖SDM培养基培养上述已筛选菌株，每株4ml按3%接菌量，37C厌氧培养20h后，取2mL培养液至已灭菌的10mLEP管中，加入0.5mL质量分数为2%的硫酸铜溶液杀死菌株。

取2mL上述含硫酸铜的培养液于EP管加入0.4mL质量分数50%的硫酸和2mL乙醚混匀，于摇床250r/min振荡摇匀45min，后离心（3000r/min，5min），取上清液于另一无菌EP管中，加入无水氯化钙脱水，取上清液利用气相色谱测定甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸及乳酸的质量浓度。

短链脂肪酸测定采用外标法，用乙酸、丙酸、正丁酸、异戊酸和乳酸做标准曲线，检测器为氢火焰检测器（FID）;

色谱条件为载气N2，分流比10:

1,流速2.0mL/min;

用DB-FFAP色谱柱（60米，内径0.25mm）;

升温程序：

120C维持5min，以15C/min升到250C保持1min，燃烧炉温280C，待测样品体积为2uL。

1.3结果

1.3.1人参多糖的提取及纯化

根据张旭等的列描述方法，利用水提醇沉法从干燥人参根中提取水溶性多糖，通过Sevag法除蛋白后，得到粗多糖，即为水溶性人参粗多糖，其提取率约为8.2%（W/W）。

收集得到的人参总多糖利用DEAE-纤维素离子交换层析住进行分离纯化，以蒸馏水为洗脱剂得到未吸附多糖部分，即中性多糖，以0.5MNaCI

为洗脱剂得到吸附多糖部分，即酸性多糖，回收率分别为50.6%和14.3%。

益生元”是一种不易被消化的食品成分，通过选择性刺激一种或少数种菌落中的细菌活性与生长而对宿主产生有益的影响，最终改善宿主的健康状态［60］。

研究报道表明某些低聚糖具有益生元活性，如低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖

等［61-62］。

这些复杂的碳水化合物在小肠内不被消化，在结肠可优先促进双歧杆菌和植物乳杆菌的生长。

最为人们所熟知的即为菊糖和低聚果糖，可选择性的刺激双歧杆菌的生长［63-65］。

因为对于益生元需求的日益增加，所以目前对于发现新的具有潜在益生元活性的碳水化合物受到极大关注。

进一步的研究重点主要是针对自然资源中所提取的多糖进行益生元活性的探索，女口：

挪威云杉、金莲花、平菇、

杏鲍菇等自然资源中所提取的多糖。

人参多糖作为人参中主要的活性成分，许多研究致力于人参多糖的提取，分离，纯化，结构分析及活性研究等，而对其益生元活性的研究报到甚少，本实验主要以人参中提取分离的中性多糖及酸性多糖为碳源培养并筛选生长状态良好的不同来源的植物乳杆菌菌株，同时检测了人参多

糖对不同菌株短链脂肪酸产量的影响。

本研究对于人参多糖潜在益生元活性的评价是通过植物乳杆菌对多糖的利用，发酵过程中以其作为主要的碳源进行生长而测定。

实验结果表明10株植物乳

杆菌在不同的人参多糖中表现出不同的生长特性。

这一结果与一些学者所报道的研究结果相一致阳。

益生菌对不同多糖的降解或发酵能力在不同种的植物乳杆菌或同一种群的不同株植物乳杆菌中具有较大差别［67］。

另外，研究表明人参中性多糖的益生元活性要强于人参酸性多糖。

导致这种结果的原因可能是因为人参多糖的结构特征所导致，如：

分子量，单糖组成，分子构象等都可能是影响多糖益生元活性的重要因素。

样品配制：

分别称取中性人参多糖及酸性人参多糖以蒸馏水为溶剂配制浓度为

0、0.5、1、2、4mg/ml的多糖溶液；

以维生素C（Vc）或乙二胺四乙酸（EDTA）作为阳性对照，配制相同浓度的对照溶液；

同时培养并制备1010CFU/ml浓度的C88菌液。

实验分组：

1Vc阳性对照组；

2人参酸性多糖组；

3人参中性多糖组；

4人参酸性多糖联合益生菌C88组（等体积C88菌泥与多糖溶液混匀）；

5人参中性多糖联合益生菌C88组（等体积C88菌泥与多糖溶液混匀）。

2.2.1.1DPPH自由基清除作用

1.5ml各样品溶液分别加入1.5ml0.1mmol/LDPPH无水乙醇溶液（避光保存，现配现用），混匀，室温避光静置反应30min后离心（4000r/min，10min，4C），取上清液于517nm处测定吸光度值，DPPH自由基清除率计算公式如下：

7mmol的ABTS溶液与2.45mmol的过硫酸钾溶液等体积充分混匀，室温避光条件下反应16h。

使用时ABTS+溶液利用乙醇溶解稀释，使得其在734nm处的吸光度值为0.7±

.02。

分别取不同浓度的样品溶液各0.5ml与2.5mlABTS+溶液充分混匀，室温下反应6min后离心（4000rpm,10min,4°

C）,在734nm处测定吸光度值。

去离子水代替样品作对照，乙醇空白，ABTS清除率计算方法如下：

5mL0.05molTirs-HCl缓冲液（PH=8.2）25C水浴20min，再加入2mL样品溶液及0.4mL25mM邻苯三酚溶液，相同温度下培养5min，最后向反应体系中加入0.5mLHCl终止反应，10min后离心（6000rpm，10min,4C）取上清320nm条件下测定吸光度，超氧化物阴离子清除率计算公式如下：

1mL不同浓度的样品溶液分别与0.05mL2mM的FeCb溶液充分混匀，静置5min后，分别加入0.2mL5mM的菲咯嗪及2.75mL的蒸馏水，充分振荡混匀，室温下静置反应10min后离心（4000rpm，10min,4C）取上清。

于562nm处测定吸光度值。

EDTA作为阳性对照。

铁离子螯合能力计算方法如下：

衰老雄性昆明小鼠（20月龄，35-45g）与青年雄性昆明小鼠（3月龄，18-22g）购于长春高新医学动物实验研究中心。

22C，昼夜循环各12h条件下饲养，适应性喂养1周，实验期间自由进食进水。

衰老昆明小鼠随机分为5组，每组8只，分别为衰老小鼠对照组，人参多糖联合益生菌C88高剂量组（多糖200mg/kg+菌1010CFU/mL）、中剂量组（多糖100mg/mL+菌109CFU/ml）、低剂量组（多糖50mg/kg+菌108CFU/mL）及Vc阳性对照组，实验组灌胃给药，每日一次，连续给药20日。

青年昆明小鼠（8

只）作为正常对照组。

衰老小鼠对照组及青年小鼠正常对照组灌胃给予相同体积的生理盐水。

最后一次给药24h后称取小鼠体重后脱颈处死小鼠，收集血液样品。

解剖分离小鼠脾脏、胸腺及肝脏。

称取小鼠脾脏及胸腺湿重，计算胸腺、脾指数，计算公式如下：

末次给药24h后，处死小鼠取血，37C放置1h,4C放置3h，离心（3000r/min，10min,4C）制备血清，-20C保存。

肝脏制备成10%的冰的生理盐水阻止匀浆，离心（3500r/min,10min,4C）,取上清，-20E保存。

测定血清及肝组织中丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力、总抗氧化活力（T-AOC）活力，超氧化物歧化酶（SOD）活力、过氧化氢酶（CAT）活力，采用比色法测定，按试剂盒说明书操作。

2.1.3.3数据分析

采用SPSS17.0软件利用方差分析完成统计处理。

计量数据以x±

s表示；

计量资料组间差异比较采用t检验。

差异显著水平为PV0.05,极显著水平为PV0.01。

2.4体外抗氧化检测结果

2.4.1DPPH自由基清除作用

DPPH是一种稳定且显紫色的自由基，最大吸收波长在517nm,广泛用于评

价抗氧化剂的自由基清除活性，当DPPH与抗氧化剂发生反应时，DPPH转变为无自由基形式的DPPH-H形式，紫色迅速褪去，与其它方法相比较更方便，且敏感度高，可检