心肌梗身后骨髓间充质干细胞治疗改良心功能及心肺苏醒结果的研究Word格式文档下载.docx

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并在心肺苏醒72h后取心肌组织进行病理切片检查。

【结果】　与注射磷酸缓冲液相较，注射MSC2周（67%±

4%vs56%±

5%，P＜）及4周后（67%±

6%vs53±

13%，P＜）射血分数明显提高，心肺苏醒前后的血液动力学参数包括心脏指数、dp/dt40、-dp/dt、左心室舒张末期压明显改善；

尽管2组的苏醒成功率没有明显区别，但72h生存率2组比较有明显不同（±

vs±

，P＜）。

心肌组织病理切片发觉有大量的PKH26标记的细胞存在。

【结论】　心肌梗身后MSC医治能明显改善心功能，同时也能明显改善心肺苏醒前后的血流动力学参数及72h生存时刻。

【关键词】骨髓间充质干细胞；

心室哆嗦；

心跳骤停；

心肺苏醒；

心肌梗死；

射血分数；

心功能

Abstract:

【Objective】Toinvestigatemyocardialfunctionandoutcomeofcardiopulmonaryresuscitation（CPR）inaratmodelofmyocardialinfarctiontreatedwithbonemarrowmesenchymalstemcells.【Methods】Athoracotomywasperformedin18rats.Myocardialischemiawasinducedbyligationoftheleftanteriordescendingartery（LAD）.4weekslater,animalswererandomizedtoreceive5×

106MSCsmarkedwithPKH26inphosphatebuffersolution（PBS）orPBSaloneasaplacebo.FourweeksafterMSCsorPBSinjection,ventricularfibrillation（VF）andCPRwereperformed.Ejectionfraction（EF）wasquantitatedtwoandfourweeksafteradministratingMSCsorPBS.Hemodynamics,includingcardiacindex（CI）,dp/dt40,–dp/dt,andLVDPweremeasuredbeforeinducingVFandhourlyfollowingreturnofspontaneouscirculation（ROSC）.MSCswerecountedin5?

滋msectionsobtainedfromeachharvestedheartwithcryostat.【Results】SignificantimprovementsinEF,CI，dp/dt40，-dp/dt，LVDPfollowedinjectionofMSCspriortoinducingVF.FollowingROSC,myocardialfunctionandhemodynamicweresignificantlygreaterinanimalstreatedwithMSCs.DurationofsurvivalweresignificantlylongerinMSCs-treatedanimalscomparedPBS-treatedanimals.【Conclusion】MyocardialfunctionbeforeandafterCPRandsurvivaltimeafterCPRweresignificantlyimprovedinanimalstreatedwithMSCscomparedtothosewhichreceivedPBS.

KeyWords:

bonemarrowmesenchymalstemcells;

ventricularfibrillation;

cardiacarrest;

cardiopulmonaryresuscitation;

myocardialinfarction;

ejectionfraction;

myocardialfunction

近几年来，细胞医治学的进展超级迅猛，利用细胞移植的方式来增加有功能的心肌细胞的数量，从而改善心功能已成为心血管疾病医治的新途径[1，2]。

以前的心肺苏醒（cardiopulmonaryresuscitation，CPR）研究利用的均是健康的动物，且研究的重点放在苏醒后药物的选择及各类器械如何改良苏醒后血流动力学[3，4]。

但临床实际情形是在CPR发生之前病人大多有严峻的心脏疾病[5]，因此本课题研究力图尽可能接近临床实际，第一结扎左冠状动脉前降支（leftanteriordesendingartery，LAD），造成较严峻的心肌缺血及缺血后心功能不全，4周后注射骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells，MSCS）或磷酸缓冲液（phosphatebuffersolution，PBS），医治的干与方法提到了CPR之前，医治4周后再诱发心室哆嗦（ventricularfibrillation，VF）及进行CPR，观看心肌梗身后MSCS医治对大鼠心功能及CPR前后血流动力学的阻碍，从而为MSCS医治心肌缺血及改善CPR的结果提供实验依据。

本研究不仅探讨MSCS改善心肌梗身后心功能不全，而且是第一次探讨心肌梗身后MSCS医治对其后发生的心跳骤停和心肺苏醒的血流动力学及生存时刻的阻碍。

1材料与方式

实验动物和细胞

成年Sprague-dawley雄性大鼠，6～8个月大小，体质量450～550g。

P3代经PKH26（美国SigmaAldrich公司）染色的MSC。

要紧仪器及材料

红外线CO2监测仪（型号IL200，美国InstrumentationLaboratory公司），小动物呼吸机（型号3500H，美国Sechrist公司），惠普超声心动图机（型号2406A，美国Hewlett-Packrad公司），除颤仪（型号Smart，美国Philips公司），监护仪（型号7010，美国Tram公司），CODAS数据搜集系统（美国DataQ公司），高敏压力转换器（型号42584-01，美国AbbottCriticalCareSystems公司）。

PE-50的塑料导管（IntramedicPE-50,美国Becton-Dickinson公司），4-F塑料导管（modelC-PMS-401J,美国CookCriticalCare公司）。

1．3实验方式

1．3．1大鼠骨髓MSC的分离、培育、传代、鉴定、染色取1月龄Sprague-Dawley大鼠，在无菌条件下警惕掏出双侧股骨和胫骨，加入10mLDMEM完全培育液，无菌注射器反复冲洗骨髓腔，将冲洗后制成的细胞悬液，600×

g离心5min，从头加入L-DMEM完全培育液10mL悬浮细胞后，移入25cm2塑料培育瓶中，二氧化碳培育箱中37℃恒温原代培育（P0）。

以后每3d改换一次完全培育液。

当细胞附壁生长至整个底层瓶壁的90%以上时，用%胰蛋白酶消化后按1∶2比例传代（为P1代）。

倒置显微镜逐日观看，重复上述操作，并记为P二、P3代。

P3的细胞将用于所有的动物实验。

取生长良好的P3代细胞，加入胰蛋白酶消化，用PBS洗涤3次，加入荧光标记抗体，4℃孵育30min，PBS洗去未标记抗体，1%多聚甲醛固定15min，应用流式细胞仪检测细胞表面抗原标记CD11b/c，CD29，CD44H，CD45，。

取生长良好且已长满瓶底的P3代细胞（细胞总量为1×

107个），加入胰蛋白酶消化，600×

g离心5min后，用PBS洗涤一次，再600×

g离心10min，用移液枪将PBS吸除干净（剩余量＜25mL），加入PKH26细胞专用液体mL，制成细胞悬液，迅速加入预先已预备好的已加入1μL荧光物质的PKH26细胞专用液体mL中，混合孵育4min，加入1%小牛血清蛋白1mL，终止染色1min，再加入完全培育液2mL，600×

g离心10min，去除上清，加入完全培育液10mL悬浮细胞，改换新的离心管，洗涤细胞共3次，显微镜下观看染色成效。

1．3．2大鼠心肌缺血模型的制备18只Sprague-Dawley大鼠随机分为实验组和对照组，每组9只动物。

在手术的前晚禁食，但可自由进水。

手术当天按45mg/kg给予腹腔内注射喷妥巴比妥麻醉。

将手术及电击部位的毛剃干净。

用14g的穿刺针套管作为气管导管插入，用线固定于嘴部皮肤，避免脱出。

置一呼气末CO2探测导管于气管导管和呼吸机导管之间，用红外线CO2分析仪监测呼气末CO2分压（PETCO2）。

调整呼吸机至工作状态，潮气量为mL/kg，呼吸频率为100次/分，FiO2=。

利用非侵入性经胸壁超声心动图测量基础心功能后开始机械通气。

从左侧第4肋间打开胸腔，暴露心脏。

用镊子撕高兴包膜，清楚暴露左前降支冠状动脉。

用带5/0细尼龙丝线的小圆针缝扎左前降支冠状动脉（leftanteriordescendingcoronaryartery，LAD）。

关胸前放入一细塑料软管，便于关胸后引流和吸取气体和渗出的血液。

LAD缝扎成功的标记是肢体心电图ST段明显举高，QRS波宽大畸形。

关胸后继续机械通气并周密观看EKG和CO2波形1h，如有VF发生，当即利用2焦的电能量电击除颤，直到心电图转复为窦性心率为止。

1h后停止机械通气，拔除引流管，按160mg/kg肌肉内注射抗菌素头孢唑啉及止痛药Ketorolacmg/kg。

动物苏醒后拔除气管导管，放回笼内继续喂养。

1．4实验进程

动物模型制备成功4周后，动物从头麻醉。

行气管插管并监测PETCO2。

用无创超声心动图检查结扎LAD的心功能。

随后该动物进行第2次开胸手术同意PKH26标记的5×

106/mLMSC或等量的PBS从梗死心肌局部注射。

放置引流软管、关胸、注射抗菌素及止痛药均与模型制备时期相同。

注射MSC或PBS4周后，动物被再次麻醉。

行气管插管并PETCO2。

游离右颈动脉，用PE-50塑料导管插入抵达左心室内,利用高灵敏性的压力传感器，用于测量左心室舒张末期压（LVDP）、左心室收缩压力上升到40mmHg时的上升速度（dP/dt40）和左心室舒张末期压（-dP/dt）。

游离右颈外静脉，用型号为4-F塑料导管插入，通过上腔静脉抵达右心房，一根尖端导电的绝缘电极由该套管插入，直到由该电极